GPR4对质子感知的进化轨迹和结构机制仍不清楚
生物体依靠感知、分析和响应内外环境的各种刺激，以维持其内部环境的平衡状态，从而在复杂多变的外部环境中生存和适应。这一过程不仅涉及对外部环境变化的快速反应，还包括对内部生理功能的精确调节。动物已经进化出pH感应膜受体，如G蛋白偶联受体4 (GPR4)，以监测与生理相关的pH变化并产生适应性反应。然而，GPR4对质子感知的进化轨迹和结构机制仍不清楚。
不同物种GPR4在质子感知中的共同机制以及物种特异性的独特机制
在这项研究中，山东大学基础医学院孙金鹏教授团队、易凡教授团队联合四川大学华西医院邓成教授团队观察到GPR4活性的最佳pH值与不同物种的血液pH值范围呈正相关。通过对热带非洲爪鼠GPR4 (xtGPR4)和小鼠GPR4 (mmGPR4)在不同pH条件下的冷冻电镜结构进行分析，作者发现HECL2-45.47和H7.36的质子化使细胞外环2 (ECL2)和7跨膜(7TM)结构域之间的极性网络建立和紧密联系。以及保守的传播路径，这些都是质子诱导GPR4在不同物种间激活的共同机制。此外，细胞外不同的HECL2-45.41的质子化有助于xtGPR4更酸性的最佳pH范围。总之，作者的研究从结构、功能和进化的角度揭示了GPR4质子感知的共同和独特机制。相关工作以“Evolutionary study and structural basis of proton sensing by Mus GPR4 and Xenopus GPR4”为题发表在Cell。
【文章要点】
一、不同物种GPR4的进化与最适pH
研究发现，GPR4基因在哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类中广泛存在。在非洲爪蟾(Xenopus)属中，GPR4基因显示出明显的正选择信号，暗示其在该属物种中可能发挥着重要的适应性功能。进一步的血pH测量结果发现，非洲爪蟾的血pH值(7.22-7.31)显著低于牛蛙(7.47-7.68)等其他两栖动物，这可能与不同物种的呼吸方式和效率有关。对GPR4的pH敏感性进行分析发现，哺乳动物GPR4的最佳pH范围为6.8-7.2，而非洲爪蟾GPR4的最佳pH却明显偏酸，在6.0-6.6之间。这种pH敏感范围的差异与不同物种的血pH值呈现良好的线性相关。进一步的实验证实，非洲爪蟾能够长时间在水下保持良好状态，而牛蛙在90分钟潜水后就出现状态恶化。通过基因替换实验，将牛蛙的GPR4基因替换为非洲爪蟾的GPR4，也能延长其潜水时间。这些结果表明，非洲爪蟾GPR4的酸性偏移可能是其适应长时间水下生活方式的一种进化结果。
图1 不同物种GPR4的进化与最适pH
二、xtGPR4-Gs和mmGPR4-Gs配合物的低温电镜结构
作者通过解析非洲爪蟾GPR4(xtGPR4)和小鼠GPR4(mmGPR4)在不同pH条件下的结构，探讨GPR4受体在酸碱变化中的构象变化及激活机制。作者成功解析了xtGPR4/mmGPR4与Gs蛋白复合体以及xtGPR4单体在不同pH条件下的高分辨率结构，分辨率范围为2.5-3.25Å。作者发现GPR4在最佳pH下呈现单一构象，而在pH升高的条件下则存在多种不同构象。通过电子密度数据建立了xtGPR4/mmGPR4受体和G蛋白三聚体的结构模型。为进一步探究质子诱导GPR4激活的机制，作者还预测并模拟了小鼠GPR4的非配体结合状态结构。这些结构生物学研究为阐明GPR4在不同pH环境下的构象变化及其激活调控机制提供了重要的结构基础。
图2 xtGPR4-Gs和mmGPR4-Gs配合物的低温电镜结构
三、mmGPR4质子传感的结构基础
作者解析了小鼠GPR4(mmGPR4)在pH 7.6、6.2和最佳pH 7.2下与Gs蛋白复合体的结构。分析发现，在最佳pH 7.2条件下，H157、H167和H271等3个组氨酸残基的质子化程度明显高于非活性状态或pH 7.6条件下，可能是关键的质子感知位点。进一步分析各质子感知组氨酸与周围氨基酸的相互作用变化:H157与F156、A153和W179形成了氢键和阳离子-π作用。H167与D163和D83形成了氢键，并发生了构象变化。H271与E172形成了氢键。实验突变验证了D163、E172等残基在质子诱导GPR4激活中的关键作用。在pH 6.2条件下，H271仅与E172形成极性相互作用，而非在pH 7.2条件下的强氢键，可能导致其活性较低。综上所述，这项结构生物学研究深入阐明了哺乳动物GPR4在不同pH条件下的质子感知机制，为理解其生理功能调节提供了重要的分子基础。
图3 mmGPR4质子传感的结构基础
四、xtGPR4和mmGPR4激活的共同机制
作者探讨了非洲爪蟾GPR4(xtGPR4)在不同pH条件下的结构变化及其与受体激活的关系，比较了xtGPR4在pH 6.2和pH 8.0条件下的结构差异。pH 6.2时，H165ECL2-45.47质子化并与D81ECL1-23.48、D161ECL2-45.43形成极性网络，使其与F167ECL2-45.49和F2727.32更紧密打包。这种打包变化引起了Y172ECL2-45.54-R2486.58和Y2757.35之间的相互作用重排。这些构象变化通过一系列疏水性残基最终传导到了"开关开关"Y2386.48，突变分析证实了这一传导通路的重要性。与xtGPR4类似，在小鼠GPR4(mmGPR4)中也发现了类似的构象传导通路，且这些关键残基在200百万年的进化中高度保守。在细胞质侧，pH变化引起了R3.50、Y3.51以及D7.49P7.50xxY7.53motif的相互作用重排，可能有助于促进G蛋白的耦合。
图4 xtGPR4和mmGPR4激活的共同机制
五、xtGPR4和mmGPR4的Gs耦合接口
作者描述了非洲爪蟾GPR4(xtGPR4)和小鼠GPR4(mmGPR4)与Gs蛋白结合界面的相似性，以及这一结合界面在不同物种间的高度保守性。尽管xtGPR4和mmGPR4的最佳激活pH范围不同，但它们与Gs蛋白的结合界面却非常相似。在29个组成GPR4-Gs结合界面的氨基酸残基中，有19个是完全保守的。Gs蛋白α5螺旋末端的3个连续亮氨酸残基与GPR4的保守疏水区域相互作用。Gs蛋白α5螺旋的Y391与GPR4的A120/A118和E53/E51形成保守相互作用。GPR4细胞内环2(ICL2)的L125/L123插入到Gs蛋白的疏水口袋中。作者进一步分析发现，组成GPR4-Gs结合界面的8个氨基酸在不同物种中都是高度保守的。作者对这些保守的关键结合界面残基进行突变，都会显著降低GPR4对质子的感知能力，说明这一Gs结合机制在进化过程中是共同保留的。总之，这一结果表明GPR4与Gs蛋白的结合界面在不同物种中高度保守，反映了一种普遍的受体-G蛋白耦合机制，为理解GPR4功能的进化提供了重要线索。
图5 xtGPR4和mmGPR4的Gs耦合接口
【结论与展望】
在本研究中，作者发现GPR4是脊椎动物中一种重要且高度保守的质子感应受体，在不同物种中感知不同的最佳pH范围。作者的工作也是一个有趣的例子，说明了一种特定的质子传感GPCR是如何进化的，以促进不同生物的生活方式。综上所述，该研究揭示了GPR4在进化过程中如何适应周围环境和pH，感知质子和调节酸碱平衡，发现了多种物种血液pH与GPR4活性最佳pH成正相关。同时阐释了不同物种中质子化诱导GPR4激活的共同机制和独特的适应机制，对质子感知受体如何激活和传递提供了相关见解。
