癌症免疫治疗领域近年来取得了显著进展，尤其是免疫检查点抑制剂（ICB）疗法的出现，为多种肿瘤的治疗带来了希望。然而，许多患者对单一ICB剂无反应，且联合治疗在一些患者中效果有限。这是因为肿瘤微环境（TME）是一个复杂的免疫抑制网络，仅靠单一靶点的治疗难以取得理想效果。在这种背景下，基因沉默技术应运而生，为癌症治疗提供了新思路。RNA干扰（RNAi）虽是传统基因沉默方法，但存在脱靶效应等局限性。而CRISPR基因编辑技术的出现，尤其是CRISPR-Cas13系统，为RNA靶向基因沉默带来了突破。Cas13d蛋白因其紧凑的尺寸，可与gRNA一同包装进AAV载体，实现多基因沉默，且其在多种细胞类型中有效，还具有免疫原性，可增强抗肿瘤免疫反应。尽管如此，Cas13d的脱靶效应和AAV载体的递送效率等问题仍待解决。在这样的背景下，组合免疫治疗的需求日益凸显，多靶点治疗成为研究热点。
中国科学院分子细胞科学卓越创新中心/耶鲁大学陈斯迪和王广川等人介绍了一种名为MUCIG的新型癌症免疫治疗方法，利用CRISPR-Cas13d系统通过AAV载体同时沉默TME中的多个免疫抑制基因（Cd274/Pdl1、Lgals9/Galectin9、Lgals3/Galectin3和Cd47），以增强抗肿瘤免疫。相关内容以“Multiplexed inhibition of immunosuppressive genes with Cas13d for combinatorial cancer immunotherapy”为题发表在《Nature Biotechnology》上。研究人员构建了AAV-Cas13d-MUCIG载体，包含Cas13d和gRNA克隆位点，用于沉默多个免疫抑制基因。体外实验显示Cas13d能高效沉默目标基因，效果优于或等同于shRNA。在E0771乳腺癌模型中，不同gRNA池（pool 1至pool 4）的实验结果显示，pool 4在减少肿瘤负荷方面效果最佳。流式细胞术分析确定了Cd274/Pdl1、Lgals9/Galectin9、Lgals3/Galectin3和Cd47这四个基因在多种癌症中广泛表达，为四基因组合治疗（AAV-Cas13d-PGGC）提供了依据。图2 四基因组合免疫疗法AAV–Cas13d–PGGC在多种癌症模型中的抗肿瘤效果研究人员通过分析确定了Cd274/Pdl1、Lgals9/Galectin9、Lgals3/Galectin3和Cd47这四个基因在多种癌症中表达丰富。AAV–Cas13d–PGGC治疗在E0771乳腺癌、Colon26结肠癌、B16F10黑色素瘤和Pan02胰腺癌模型中显著抑制了肿瘤生长，并通过流式细胞术验证了其对目标基因的敲低效率，重塑了肿瘤微环境，减少了免疫抑制细胞，增加了肿瘤浸润性T细胞。图3 AAV–Cas13d–PGGC治疗对肿瘤微环境的重塑效果通过流式细胞术和单细胞RNA测序，研究人员发现该治疗显著增加了肿瘤浸润性T细胞的数量，减少了免疫抑制细胞如MDSCs和中性粒细胞的数量，并下调了与免疫抑制相关的基因表达，从而增强了抗肿瘤免疫反应。图4 Cas13d和shRNA在基因沉默治疗中的比较AAV–Cas13d和AAV–shRNA在转导效率和体外基因敲低效率上相似，但在体内抗肿瘤效果上，AAV–Cas13d–PGGC比AAV–shRNA–PGGC更有效，暗示Cas13d可能通过额外机制增强抗肿瘤反应。研究人员通过瘤内注射AAV–Cas13d到携带不同肿瘤的小鼠中，发现与对照组相比，AAV–Cas13d显著增加了肿瘤、脾脏和淋巴结中CD8+和CD4+ T细胞中IFN-γ的表达，增强了T细胞的免疫反应，这可能有助于提升抗肿瘤免疫效果。图6 优化的hfCas13d系统在抗肿瘤免疫中的应用研究发现hfCas13d与Cas13d在基因敲低效率上相似，且hfCas13d的脱靶效应最小。通过优化启动子，增强了AAV介导的Cas13d表达，显著减少了肿瘤负荷。在E0771肿瘤模型中，hfCas13d-PGGC治疗有效减少了肿瘤体积，且未引起明显不良反应。MUCIG相较于抗体疗法，具有治疗效果持久、注射次数少、灵活性和模块化强等优势。它通过定制gRNA池，能够快速适应不同的治疗需求，实现对多种免疫抑制基因的多重靶向，以可编程的方式同时抑制多个免疫检查点，既能提供通用的“现成”疗法，又能根据肿瘤微环境进行定制化治疗。在安全性上，使用Cas13d有效规避了Cas9或Cas12a引起的非预期DNA损伤问题，且Cas13d更紧凑，可用于一体化AAV递送，其递送方式还可拓展至其他病毒或非病毒载体，进一步拓宽了MUCIG的应用范围。尽管Cas13d gRNAs存在脱靶效应，但新研究不断探索出减少脱靶的新方法，如高保真版本MUCIG AAV - hfCas13d - PGGC显示出良好效果，其他Cas13d效应器的发现也将增强AAV - Cas13d的应用潜力。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41587-024-02535-2
来源：BioMed科技
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