利用效应蛋白对土传真菌病原菌的微生物组进行操纵

概要

在侵染宿主的过程中，病原体通过各种机制分泌效应蛋白以促进疾病的发展。越来越多的证据表明，宿主的微生物组对健康起着至关重要的作用，并且宿主会主动塑造其微生物组以抑制疾病的发生。我们推测病原体进化出了操控宿主微生物组的能力来获取自身的优势。本研究发现之前鉴定出的致病效应蛋白VdAve1，由植物病原真菌Verticillium dahliae分泌，具有抗菌活性，并通过抑制对抗性细菌来操控番茄和棉花的微生物组，进而促进了病原体对这些宿主的侵染。此外，研究还表明VdAve1以及新鉴定的抗菌效应蛋白VdAMP2，在土壤环境中也被用于微生物组的操控，即在没有宿主的情况下，真菌仍能利用这些效应蛋白调节其周围的微生物组成。综上所述，本研究证明了一种植物病原真菌如何利用效应蛋白来调控宿主内外的微生物组构成，并提出病原体的效应蛋白目录可能是一个未被充分利用的新抗生素资源库。

VdAve1功能验证

为了验证这个猜想，首先需要获得纯化的Ave1蛋白：大肠杆菌异源表达后纯化，但是抗菌肽（AMP）由于其抗菌活性普遍难以成功。为此（从大肠杆菌中分离包涵体，并用盐酸胍使其变性。接下来，通过逐步透析重新折叠 VdAve1，并通过测试其免疫受体 Ve1 的识别来确认功能性)(获得不好异源纯化蛋白的方法)，之后验证VdAve1的功能：

挑选了多种与番茄相关的细菌，在加或不加VdAve1的情况下测定细菌的生长曲线。结果表明VdAve1显著抑制了革兰氏阳性菌（如枯草芽孢杆菌），而革兰氏阴性菌受影响程度存在差异，话发现VdAve1显著抑制了Sphingobacterium sp. 和Sphingomonas mali两类细菌生长。

在以上研究基础上，使用电子显微镜观察了VdAve1处理对于枯草芽孢杆菌的影响——是抑制生长还是杀死细菌。结果表明在最低抑菌浓度（MIC）下更低的浓度已经引起了枯草芽孢杆菌的细胞起泡和肿胀以及随后裂解和崩溃，表明 VdAve1 的抗菌活性可能基于杀菌活性

以上实验说明了VdAve1作为一种AMP确实存在抗菌活性，接着思考这种抗菌活性是VdAve1特有的还是在其同源蛋白中保守：在轮枝菌属仅发现一个同源蛋白即来自非致病种V. nubilum 的VnAve1，以及几个植物中的同源蛋白（拟南芥），发现这些蛋白具有一定的抗菌活性，能抑制VdAve1抑制的一部分细菌，这说明Ave1的同源蛋白具有普遍的抗菌活性，且不是在该基因从植物中水平转移到真菌后新获得的。

VdAve1在影响根际微生物群落组装中的作用及机制

既然VdAve1通过抗菌活性影响了其他微生物的生长，那是否可以进一步影响宿主微生物组装呢？为了探究这个问题，本文对接种野生型和VdAve1缺失突变体Vd的番茄和棉花根部微生物进行了16S测序，取样时间为10dpi，此时为感染早期，真菌已经完成定殖影响了微生物组成，但还没有产生严重的疾病，因此可以认为此时根际微生物的差异是由真菌的差异引起的而非植物病症引起的（取样时间）：

β多样性分析表明不同处理下的番茄和棉花根际微生物发生了显著的分离，其中VdAve1的缺失显著影响了番茄根系 Sphingomonadales、Bdellovibrionales和Ktedonobacterales的丰度；同样的在棉花中发现Sphingomonadales（鞘脂单胞菌目）仅在VdAve1缺失突变体中独家且持续地发现；基于以上结果，在接种VdAve1的棉花根部筛出了Sphingomonadales目中四个属的细菌（Sphingomonas、Novosphingobium、Sphingopyxis和Sphingobium ）

为了验证VdAve1的功能，使用纯化蛋白处理植物相关微生物合成群落并进行16S测序，结果与预期相符，VdAve1的存在显著抑制了Sphingomonadales的丰度，这些实验证明VdAve1确实直接操纵了微生物群落的组成；

此外在土壤和补充土壤浸提液的MS培养基中进行了培养，结果表明相较于缺失突变体，存在土壤微生物群落时野生型Vd拥有更大的生物量积累，而在没有土壤微生物时这种差异消失了，说明VdAve1通过其抑菌活性促进了Vd的生态位占领（真菌分泌蛋白抑制其他微生物实现优先效应的例子）

以上结果表明Vd通过分泌VdAve1抑制Sphingomonadales促进自身定殖，是否意味着Sphingomonadales也能对Vd起到抑制作用，拮抗病原菌定殖呢？基于此本文分别在存在Novosphingobium和Sphingopyxis macrogoltabida的培养液中接种不同基因型的Vd，发现这两种菌显著抑制了缺失突变体的定殖；而在表面消毒的番茄种子预接种Sphingopyxis macrogoltabida也可以显著抑制黄萎病的发生。

至此结束了全文对于VdAve1的研究，VdAve1作为植物病原菌Vd的分泌蛋白，被分泌到根际后通过其抗菌活性抑制接抗菌Sphingomonadales目下几个属细菌的生长，降低了这些细菌在根际微生物群落中的丰度并影响了根际微生物群落的结构，使得更有益于自身的定殖。

此后文章探究了已知抗菌蛋白（AMP）在Vd中的同源蛋白，但转录组数据表明这些蛋白通常并不表达，但找到候选基因VdAMP2在土壤浸提液中表达，通过获得纯化蛋白后通过共培养法发现VdAMP2也可以抑制一部分细菌的生长，且在存在土壤微生物时可以促进Vd的生物量积累，这说明VdAMP2虽然和VdAve1具有不同的抑菌活性谱，但都可以通过抑制部分细菌活性操纵根际微生物群落的组成，进而间接为Vd的治病能力做出贡献。

根际互作生物学研究室 简介
根际互作生物学研究室是沈其荣院士土壤微生物与有机肥团队下的一个关注于根际互作的研究小组。本小组由袁军教授带领，主要关注：1.植物和微生物互作在抗病过程中的作用；2 环境微生物大数据整合研究；3 环境代谢组及其与微生物过程研究体系开发和应用。团队在过去三年中在 Nature Communications，ISME J，Microbiome，SCLS，New Phytologist，iMeta，Fundamental Research， PCE，SBB，JAFC（封面），Horticulture Research，SEL（封面），BMC plant biology等期刊上发表了多篇文章。欢迎关注 微生信生物 公众号对本研究小组进行了解。

撰写：李子涵
修改：文涛
排版：刘炜烨
审核：袁军
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