系统讨论和比较合成微生物群落构建方法

概要总结

本文综述了合成微生物群落的构建方法及其在多个领域的应用。微生物在地球生态系统中扮演着重要角色，近年来的研究焦点已从单个微生物转向整个微生物群落的复杂相互作用。合成微生物群落通过共培养不同野生型细菌种类和工程菌株构建，能够展现出优于单一菌株的稳定性、适应性和效率。与自然微生物群落相比，合成微生物群落在复杂性、可控性和可重复性方面具有明显优势。本文介绍了合成微生物群落的四种构建方法：分离培养法、核心微生物群挖掘法、自动化设计和基因编辑技术，并分析了每种方法的特点、优势与局限性。

研究背景

微生物普遍存在于陆地和水生环境中，包括大气、海洋、土壤、植物、动物和人体。其庞大的种群对于生物地球化学循环和自然生态系统至关重要。早期的生物学研究主要关注微生物群落中的关键功能群，特别是通过分离和改造单个微生物以增强特定功能。然而，当前对环境微生物的研究逐渐从分析个体转向研究整个群落系统，将环境中的微生物视为一个复杂的共生网络，具有相互作用和共同进化的特征。鉴于目前在疾病治疗、环境管理、人类健康和工业生产方面面临的挑战，仅评估单一菌株的单一功能已不能满足需求。许多复杂的生理和生化过程无法通过单个微生物有效解决或激活，因为个体微生物对环境干扰的适应性较差。与单一菌株相比，微生物群落展示了广泛的代谢多样性和对复杂环境的增强适应性，通过分工提供了更稳定的生态功能。然而，研究自然微生物群落是一项特别困难的任务，由于其高度复杂性，限制了我们对其作用机制的阐明，以及对其在自然环境中行为的预测能力。这种限制极大地阻碍了我们理解自然系统中物质运输和转化的努力，限制了微生物资源的高效利用。

合成微生物群落

近年来，微生物组学、计算生物学、合成生物学和培养学的快速进步使研究人员能够构建高效且稳定的合成微生物群落。合成微生物群落是通过共培养不同野生型细菌种类和工程菌株人工合成的微生物系统。本质上，合成微生物群落结合了具有不同功能特征的多种共存微生物。这些微生物在保留自身特征的同时，通过人工选择能够互补或协同其他微生物的功能特征，从而提供自然微生物群落的优势。目前，合成微生物群落技术已被广泛研究并应用于植物生长、营养吸收和疾病控制等领域，例如在拟南芥、玉米、水稻和番茄中。合成微生物群落还在污染物降解、药物、生物燃料和蛋白质复合物生产、功能性生物材料制备以及生物传感器构建方面具有很高的应用前景。

与单一微生物相比，复杂的合成微生物群落预计具有更好的稳定性、适应性、效率和代谢灵活性。首先，在稳定性方面，成熟的合成微生物群落由多种微生物组成，主要表现出协同作用。这些相互作用增强了群落的稳健性，多样性的物种缓冲了外部干扰，保持了整体稳定性。其次，在适应性方面，当环境变化抑制或失活某些菌株时，其他菌株可以填补空缺，保持整体功能平衡。由于这种适应性，微生物群落能够更好地调整自身以应对环境波动和外部压力。在效率方面，成熟的合成微生物群落代表了一种先进的生物生产系统，通过将复杂的代谢过程分解并分配给不同菌株来减轻单一菌株的代谢负荷，从而提高了整体生物生产效率。在代谢灵活性方面，在成熟的合成微生物群落中，不同菌株利用特定的底物和营养物质形成互补的代谢网络，显著提高了群落的整体资源利用率。此外，合成群落产生的多种代谢产物能够有效催化许多复杂的生化过程，这是单一菌株难以实现的。

与自然微生物群落相比，合成微生物群落具有低复杂性、高可控性和高重现性等优点，并且可以设计为具有目标功能。首先，合成微生物群落由于其相对简单的结构和设计，整体复杂性远低于自然微生物群落。其次，在高可控性方面，自然微生物群落的多样性受环境和多种复杂因素影响，难以控制。相比之下，合成微生物群落的多样性通过设计和调整其微生物组成、丰度和相互作用来精确控制。最后，在高重现性方面，合成微生物群落通常在控制的实验室条件下构建，具有明确的物理化学特性，从而通过精确的构建过程实现高度重现性。合成微生物群落技术的快速发展，为人类健康、工业生产、污染物降解和食品发酵等领域带来了新的机遇，展示了其在生物技术中的巨大潜力。

分离培养法

利用高通量培养和分离技术广泛分离和培养微生物种类。然后，根据所需功能进行微生物菌株的筛选和拮抗性测试，以获得由共生候选菌株构建的合成群落。步骤如下：（1）分离与培养：采用传统微生物分离技术或高通量培养方法系统地分离和培养样本中的微生物菌株，从而建立全面的菌株资源。（2）筛选：对分离的菌株进行功能测试，筛选出具备合成群落所需功能（如固氮、溶磷、降解污染物、IAA 生产和抗病性）的候选菌株。（3）共培养：候选菌株按不同组合和比例共培养（可通过微生物功能代谢网络或实时定量 PCR 确定），评估共培养菌株的生长。无生长抑制现象表明菌株间无拮抗作用，从而建立合成群落。（4）合成微生物群落构建：在无菌条件下，根据特定功能响应（性状、生理、代谢等）评价所选菌株组合的功能性，选择一个或多个最有效的人工群落。（5）功能验证：优化菌株组合后，在自然环境下对合成群落的功能性进行实验验证。

Durán 等人通过此方法从拟南芥共生微生物中筛选出 148 种细菌、34 种真菌和 8 种卵菌作为候选菌株，通过2862 次拮抗实验（体外二元细菌-真菌相互作用结合植物体内群落干扰实验）组装了七个复杂合成微生物群落。实验验证表明，细菌-真菌和卵菌组成的合成微生物群落显著促进了植物生长。同样，Li 等人从黄芪、根际分离出 423 株细菌，根据其促生和抗病性筛选出 10 株高丰度和 3 株低丰度菌株。通过将13种细菌组合成三个不同的合成微生物群落，他们验证了包含Stenotrophomonas spp.、Rhizobium spp. 和Advenella spp. 以及Ochrobactrum spp. 的合成群落在黄芪上的良好生和抗根腐病功能。

核心微生物群挖掘法

基于高通量测序数据分析，定义核心微生物类群并针对性分离核心微生物菌株，通过进一步的功能筛选、共生测试和实验验证步骤构建合成微生物群落。步骤如下：（1）样品采集：选择研究对象并采集微生物样品。（2）高通量测序：提取样品宏基因组DNA，进行高通量测序和特征分析。（3）核心微生物群定义：基于高通量测序数据，通过共生网络分析和微生物群落的功能预测，挖掘相关的核心功能微生物。（4）分离与筛选：根据结果有针对性地分离和培养核心微生物菌株。（5）共生测试：对核心微生物菌株进行功能优化和共生、拮抗性测试，如对病原微生物的拮抗活性和促植物生长特性。（6）构建：在实验条件下，按特定比例混合和培养最佳性能的微生物，构建合成微生物群落。（7）功能验证：在自然或人工控制条件下，通过特定代谢途径的活性等指标评估构建的合成微生物群落的功能。

Wu 等人通过此方法分析香肠发酵过程中优势属的相对丰度、香味增强能力和共生性能，筛选出乳酸菌属、葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属和双球菌属五个核心微生物属。然后，从每个属中筛选出相对丰度最高的物种，利用这些代表性菌株的混合培养构建合成微生物群落。验证实验表明，合成微生物群落改善了香肠的香气。Li 等人结合PacBio全长多样性测序和传统培养方法，识别出11种核心功能微生物，这些微生物通过代谢网络分析、共生分析和功能筛选影响了四川太阳醋的发酵风味。由这些菌株构建的合成微生物群落赋予四川太阳醋关键风味，并促进了氨基酸的生产。Qiao等人从田间种植的嫁接西瓜植物的根际分离出394株细菌，通过统计分析筛选出16株核心菌株构建合成微生物群落。该群落被发现能增强在非无菌土壤中种植的非嫁接西瓜的生长和抗病性。后续研究进一步确定了由八株细菌组成的精简合成群落，也具有促植物生长和抗病功能。

自动化设计

在分离和鉴定出大量微生物菌株后，基于其分子数据建立微生物-微生物和微生物-代谢相互作用模型，以确定合成微生物群落的最佳组合。步骤如下（1）分离与鉴定：利用传统的微生物培养技术大规模分离和培养与样品相关的微生物菌株，并对其进行分子特征分析，以建立菌株库。（2）代谢网络模型：将这些微生物菌株输入代谢网络模型，预测不同微生物之间的相互作用、代谢物流动和最佳微生物组合。（3）算法优化：利用进化、遗传和优化算法等方法，在大量可能的组合中确定最佳微生物组合。（4）高通量筛选：通过微流控微阵列和多样本分析平台等高通量技术，快速评估大规模微生物组合的性能。（5）构建：根据模型预测和算法结果，按所呈现的微生物组合和比例构建合成微生物群落。（6）实验验证：通过实验室测试合成微生物群落，评估其是否实现预期功能，以验证模型和算法的准确性。

Karkaria等人通过使用顺序蒙特卡罗抽样的近似贝叶斯计算进行模型选择和参数化，设计了稳定的遗传振荡器和多稳定遗传开关。这些作者在确定生成稳定群落的最佳候选系统后，通过自动化设计选择出生成稳定两菌株和三菌株群落的候选菌株。Harcombe等人引入了一个称为计算微生物生态系统的时空（COMETS）的多尺度建模框架，用于计算基于详细细胞内代谢计量的生态系统时空动态，并在网格上实施动态通量平衡分析算法，以追踪复杂环境中多个微生物种群的时空动态，达到全基因组水平分辨率。通过这些COMETS计算，他们构建了由大肠杆菌和肠道沙门氏菌组成的两菌株合成群落，以及另外加入了红假单胞菌的稳定三菌株合成群落。

基因编辑

通过基因编辑方法对个体菌株进行特定特征或功能的靶向遗传修改，随后与其他菌株组合，构建具有特定功能和相互作用的合成微生物群落。

步骤：（1）选择目标菌株：选择用于构建微生物群落的微生物菌株，这些菌株可以是自然存在的或经过基因编辑的菌株。（2）设计编辑目标：利用基因组学和代谢组学等技术分析目标菌株的基因和代谢网络，确定需要编辑的目标基因或代谢途径。（3）基因编辑：使用CRISPR-Cas9等方法对选定位点进行基因敲入、敲除或修改。（4）编辑效果评估：通过PCR、测序和代谢物分析等技术确认预期的编辑效果。（5）构建：将编辑后的菌株按适当的培养条件和菌株间相互作用共培养，构建合成微生物群落。（6）功能验证：通过代谢物分析和功能鉴定等方法，在培养物中评估构建的微生物群落的稳定性和功能。

案例：Losoi等人共同培养野生型菌株Acinetobacter baylyi和基因敲除菌株AbΔgntT与大肠杆菌EcΔptsI，因为AbΔgntT能代谢葡萄糖产生葡糖酸，但不能代谢葡糖酸，而EcΔptsI只能代谢葡糖酸产生乙酸。因此，这两种菌株通过交换葡糖酸和乙酸形成合作关系，维持彼此的生长，同时形成稳定的合成微生物群落。Pande等人利用KEGG途径数据库确定大肠杆菌和Acinetobacter baylyi基因编辑的目标基因，删除与组氨酸（His）和色氨酸（Trp）合成途径相关的基因。结果表明，这两种营养缺陷菌株在没有外部提供His或Trp的情况下无法生长。当这两种缺乏营养的菌株共培养并交换所需氨基酸时，它们形成了一个具有合作关系的合成群落。Wen等人构建了一个由工程菌株Clostridium cellulovorans（过表达异源adhE1基因）与Clostridium beijerinckii NCIMB 8052组成的合成微生物群落。在83小时内，该工程共生体能够发酵30.1 g/L的碱提取脱脂玉米芯，产生3.94 g/L的丁醇，而无需调整pH值，其产量是野生型菌株共生体的五倍多。

本综述比较分析了分离培养法、核心微生物群挖掘法、自动化设计和基因编辑的特点。这四种方法都是基于“自下而上设计”的原则。与核心微生物群挖掘法、自动化设计和基因编辑相比，分离培养法的技术门槛和实验操作要求（专业技能和知识）相对较低。此外，自动化设计和基因编辑还依赖于专业设备。

每种方法都有其特定的特点（表中对比了五种构建方法所需仪器、技术门槛、优点、限制及适用场景）：

1. 分离培养法：是一种高度可重复的方法，技术门槛低，通过反复试验逐步改进微生物群落的构建。

2. 核心微生物群挖掘法：通过针对性地分离核心菌株，减少了工作量。使用这种方法合成的微生物群落具有高度的多样性，生态适应性强，并且不会破坏环境中原有的微生物多样性。

3. 自动化设计：是一种高效且精确的方法，可以快速筛选合适的微生物菌株并优化组合比例。

4. 基因编辑技术：可以精确地修改微生物菌株的基因组，引入所需的代谢和产品合成功能，迅速生成具有特定功能的微生物群落。

除了优势，每种方法也有其固有的局限性。由于自然环境中微生物相互作用和竞争的复杂性，通过自动化设计合成的微生物群落必须经过广泛的实验验证以评估其有效性。通过分离培养法构建合成微生物群落是一种耗时的方法，需要处理大量的微生物数据，并且在构建过程中微生物种类的比例难以控制。核心微生物群挖掘法是一种耗时的方法，需要大量资源来定义、筛选和优化核心功能菌株。基因编辑需要选择适当的基因编辑技术，并维持微生物菌株的稳定性和遗传安全性。

挑战与展望

尽管我们付出了很多努力，合成微生物群落的构建仍然面临重大问题。基于高通量测序，可以通过各种算法、统计和模型确定合成微生物群落成员的分类数据，但微生物资源仍然是成功构建合成微生物群落的关键。虽然培养基因组学、微生物标记基因的扩增测序等新技术大大提高了我们对可培养微生物多样性的理解，合成微生物群落的构建仍处于发展的初期阶段。换句话说，合成微生物群落的构建依赖于微生物资源。

目前，大多数研究集中于成对的相互作用，忽视了更高层次的微生物相互作用可能带来的显著影响。更高层次的相互作用是指生态系统中两个或多个物种之间的关系。通过探索这些更高层次的相互作用，我们可以更全面地了解生态系统的结构和功能，以及不同物种之间的相互依赖性。此外，共存理论和稳定性与功能理论探讨了在资源有限和可能存在竞争的环境中，不同物种如何共存，以及它们在面对干扰和变化时如何保持功能和稳定性。因此，在构建合成微生物群落的过程中，探索更高层次的相互作用、共存理论和稳定性与功能理论尤为重要，这有助于扩展我们对生态系统功能的理解，并有助于构建更符合生态理论的合成微生物群落。

目前，合成微生物群落的功能验证是一项耗时、昂贵且困难的操作，因此当前的研究集中在利用分子技术的进步精确定制合成微生物群落的功能。例如，通过选择合适的微生物种类、调整其组成比例和编辑特定功能的基因，可以优化合成微生物群落在环境污染物降解、特定化合物生产和植物生长促进等方面的具体功能。

总体而言，合成微生物群落是一个充满潜力的领域。然而，要通过广泛应用于农业生产、环境修复、生物医学等领域实现其潜力，还需要进一步进展。在此，我们提出了一些实现这一目标的策略。首先，可以利用基因编辑技术获取关键微生物资源。基于微生物组学定义的关键微生物的功能基因，通过基因编辑使受体菌株具备与关键菌株相同的功能，从而生成高效且稳定的合成微生物群落。其次，获得具有特定功能的多样化微生物候选菌株对合成微生物群落的精细设计至关重要。然而，庞大的微生物数据量构成了相当大的挑战。因此，包括机器学习和人工智能（AI）在内的计算工具对于从庞大的数据集和培养物收藏中识别潜在的微生物菌株是不可或缺的。这些工具在生物医学领域特别是在新抗生素发现中已显示出其效能，但在合成微生物群落组装中的应用仍有待探索。机器学习和AI对于预测微生物驱动的合成群落的构建至关重要，有望将这一领域推向前所未有的高度。第三，从微生物组合转向由核心功能微生物（益生菌）及其有益宿主代谢产物（益生元）组成的共生组合，可能有助于合成微生物群落克服季节性环境和土壤微生物群落波动带来的影响。例如，植物不是孤立的个体，而是与众多微生物共生的系统。植物代谢对于维持微生物之间的相互作用至关重要。因此，共生组合可能是一种新方法，能够在合成微生物群落中实现高效、持久和稳定。