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Defensive alteration of root exudate composition by grafting Prunus sp. onto resistant rootstock contributes to reducing crown gall disease 嫁接是抑制土传疾病的传统且重要的策略，例如由致瘤农杆菌和根瘤菌引起的冠瘿病。根系分泌物和根际微生物组在控制冠瘿病中发挥着关键作用，但它们在抑制嫁接植物冠瘿病中的作用仍不清楚。在此，将易病樱桃砧木“吉塞拉6号”和抗病樱桃砧木“海鹰1号”进行嫁接或自嫁接。研究了其根系分泌物对土壤微生物组组成和致病农杆菌丰度的影响。嫁接到抗病砧木上有助于减少致病性农杆菌的丰度，同时改变根系分泌物，丰富潜在的有益细菌，并改变土壤功能。然后，分析了嫁接植物根系分泌物的成分，并鉴定了导致致病性农杆菌丰度降低的潜在化合物。基于对化合物浓度的定量测量并测试所提供的纯化学品对致病性农杆菌和潜在有益细菌的丰度和趋化性的影响，发现嫁接到抗性砧木上的植物根系分泌物中缬氨酸的减少有助于减少农杆菌丰度，富集一些潜在的有益细菌并抑制冠瘿病。这项研究提供了对嫁接植物抑制土传疾病的机制的见解。首先通过无菌实验表明土壤微生物组是影响‘海鹰1号’幼苗抗冠瘿病的重要因素。采集抗病品种和感病品种的1年生苗进行嫁接，包括将抗病品种嫁接到感病品种砧木上（R-S），将感病品种嫁接到抗病品种砧木上（S-R），将抗性品种嫁接到抗性品种砧木上（R-R），将感病品种嫁接到感病品种砧木上（S-S）。R-R 植物的病害指数最低，而 S-S 植物和 R-S 植物的病害指数要高得多。S–R 的病害指数仅为 S–S 和 R–S 植物的一半（图 1A）。从四种处理中收集根系分泌物处理相同的均质土壤，并测量土壤中致病农杆菌的丰度。与未处理的土壤相比，用 R-R 的根系分泌物处理土壤降低了致病性农杆菌的丰度，而用 S-S 的根系分泌物处理土壤则增加了致病性农杆菌的丰度（图 1B）。用 S-R 根系分泌物处理的土壤中致病性农杆菌的丰度低于用 S-S 处理的根系分泌物处理的土壤中致病性农杆菌的丰度。然而，与S-S相比，R-S的根系分泌物并没有减少致病性农杆菌的丰度（图1B）。这些结果表明，具有抗性砧木的嫁接植物的根系分泌物可以减少土壤中致病性农杆菌的丰度。此外，嫁接植物的冠瘿病指数表现出与土壤中致病农杆菌丰度相似的特征（图1A）。疾病指数与致病农杆菌丰度呈正相关（图1C）。这些发现表明，受根系分泌物影响的土壤中致病性农杆菌丰度的减少可能在嫁接到抗性砧木上的植物的疾病指数降低中发挥重要作用。通过高通量测序分析了用嫁接植物的根系分泌物处理的土壤中的细菌群落。PLS-DA 显示，5 个经根系分泌物处理的土壤中的微生物群落明显不同（图 2A）。最丰富的六个门是Proteobacteria、Acidobacteriota、Actinobacteriota、Gemmatimonadota、Chloroflexi和Bacteroidota（图2B）。在门水平上，与具有敏感砧木（S）的嫁接植物相比，具有抗性砧木（S-R和R-R）的嫁接植物的根系分泌物增加了土壤中Proteobacteria、Gemmatimonadota和Fusobacteria三个门的相对丰度， Acidobacteriota、Entotheonellaeota 和 Zixibacteria 三个门却减少了（图 2C）。与致病农杆菌具有最高 16S 序列相似性的 ASV 丰度概况与通过 qPCR 测量的致病农杆菌丰度概况相似。指标分析显示，嫁接樱桃植株的根系分泌物主要影响变形菌门、酸杆菌门和绿柔菌门的相对丰度（图2D和E）。每个嫁接植物的根分泌物对应于门的特定子集。例如，指示S-S植物根系分泌物的ASVs较高比例属于Chloroflexi和Proteobacteria（50%），指示S-R植物根系分泌物的ASVs较高比例属于Acidobacteriota和Cyanobacteria（46.67%） ，表明 R-S 植物根系分泌物的 ASV 比例很高，属于 Actinobacteriota 和 Chloroflexi (76.92%)（图 2D 和 E）。指示 R-R 植物根系分泌物的 18 个 ASV 属于 Proteobacteria 和 Gemmatimonadota (100%)，其中 7 个 ASV 属于 Gemmatimonadales 和 Sphingomonadales 目，这些 ASV 被认为是对植物有益的细菌群（图 2D 和 E） 。为了了解重组细菌群落对病原体丰度的影响，分析了病原体与其他细菌的相关性。发现13个鉴定的属与致病农杆菌的丰度显着相关，其中 Sphingomonas, Dokdonella, Thermomonas, Gemmatimonas和Roseisoilibacter与病原体丰度显着呈负相关（图3A）。在这些属中，Gemmatimonas和Sphingomonas被认为是有益的属（图3B和C）。使用基于 16S rRNA 数据集的 Tax4Fun 软件预测了群落函数 。对重组土壤细菌群落的KEGG途径中与抗病性相关的预测基因进行了比较分析。与S-S植物相比，S-R植物富集了多个KEGG途径，包括“类固醇生物合成”、“青霉素和头孢菌素生物合成”、“单萜生物合成”和“异黄酮生物合成”（图 3D）。为了鉴定根系分泌物中负责调节土壤中致病农杆菌丰度的化合物，对根系分泌物的成分进行了分析。鉴定出的化合物包括 8 种胺、23 种氨基酸、7 种酯、13 种脂肪酸、7 种酮、36 种有机酸、22 种其他酸、21 种糖、5 种糖酸、9 种糖醇、13 种其他醇和 36 种其他。PLS-DA 显示四种处理的根系分泌物彼此明显分开（图 4A）。不同处理下根系分泌物和类别的相对含量如图4B和C的热图所示。为了进一步探索潜在信号，对致病性农杆菌和根分泌物中每种化合物之间的丰度进行了相关分析。缬氨酸、苯乙酸、4-氨基苯酚、乳酰胺和 6-羟基己酸，被选为影响的潜在化合物。缬氨酸的丰度与致病农杆菌的丰度呈正相关（图4E和5A）。苯乙酸、4-氨基苯酚、乳酰胺和6-羟基己酸的丰度与致病农杆菌的丰度呈负相关（图4F-I和5B-E）。除了致病性农杆菌外，属于放线菌门和变形菌门的许多其他 ASV 与这五种化合物显着相关。将五种纯化合物施用于土壤，并测定了患病土壤中致病性根癌农杆菌的丰度。土壤中致病性农杆菌的丰度随着缬氨酸、4-氨基苯酚或乳酰胺的增加而增加（图5F、H和I），并随着6-羟基己酸含量的增加而减少（图5J）。病原体和苯乙酸之间没有观察到明显的趋势（图5G）。为了进一步确认这些化合物是否以有效浓度存在于根系分泌物中，我们根据标准品，通过 UHPLC-MS 定量测量了缬氨酸、4-氨基苯酚、6-羟基己酸、苯乙酸和乳酰胺的浓度。结果表明，根系分泌物中均微量存在苯乙酸、4-氨基苯酚和6-羟基己酸（图5L、M和O）。尽管乳酰胺的浓度为1μM，但乳酰胺对根癌农杆菌的丰度没有表现出显着影响（图5I和N）。根分泌物中缬氨酸浓度的降低已被证明对根癌农杆菌有影响。与S-S根分泌物中缬氨酸的浓度相比，S-R根分泌物中缬氨酸的浓度降低（图5A和K）。推测嫁接在抗性品种而非感病品种上的植物根系分泌物中缬氨酸的减少导致了根癌农杆菌丰度的降低。为了进一步分析缬氨酸与致病性农杆菌之间的关系，预测了土壤中缬氨酸的相关功能，并测试了缬氨酸对病原体趋化性和冠瘿病的直接影响。预测的缬氨酸合成功能水平与病原体丰度呈正相关（图6A），与缬氨酸对病原体丰度的直接影响一致（图5F）。此外，随着缬氨酸浓度的增加，病原农杆菌的趋化性增强（图6B）。疾病指数也随着缬氨酸浓度的增加而增加（图6C）。这些结果表明，嫁接到抗性品种上的植物根系分泌物中缬氨酸的减少可能有助于抑制冠瘿病。由于缬氨酸根部分泌物的减少和根际群落中有益微生物的丰富被认为在减少根癌农杆菌的丰度方面发挥了作用，那么根际细菌群落功能是否与缬氨酸有关。维恩分析显示，与缬氨酸生物合成和缬氨酸降解特有途径显着相关的属数分别为 3 个和 17 个。与两条途径显着相关的属数为3个。大多数属与缬氨酸降解显着相关（图6D）。在这些属中，Gemmatimonas的丰度与缬氨酸降解途径呈显着正相关，与缬氨酸生物合成途径呈负相关。五个属与缬氨酸和病原体丰度显着相关，分别属于变形菌门、放线菌门和芽胞藻门。在这些属中，有益的Gemmatimonas和Sphingomonas 与缬氨酸和病原体丰度呈负相关（图6E）。测量了缬氨酸对这两种有益细菌的直接影响。结果表明，缬氨酸在终浓度为 1、10 和 100 μM 时，可作为这两种细菌的驱避剂（图6F和G）。总之，缬氨酸对这两种属的趋化性和生长的影响与相关分析一致（图6E）。这些结果表明，嫁接到抗性品种上的植物根系分泌物中缬氨酸的减少有助于丰富有益细菌。根际互作生物学研究室 简介
根际互作生物学研究室是沈其荣院士土壤微生物与有机肥团队下的一个关注于根际互作的研究小组。本小组由袁军教授带领，主要关注：1.植物和微生物互作在抗病过程中的作用；2 环境微生物大数据整合研究；3 环境代谢组及其与微生物过程研究体系开发和应用。团队在过去三年中在 Nature Communications，ISME J，Microbiome，SCLS，New Phytologist，iMeta，Fundamental Research， PCE，SBB，JAFC（封面），Horticulture Research，SEL（封面），BMC plant biology等期刊上发表了多篇文章。欢迎关注 微生信生物 公众号对本研究小组进行了解。
撰写：杨雯儀
修改：文涛
排版：杨雯儀
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