Synthetic microbe-to-plant communication channels
概要
植物和微生物通过沟通协作来阻止害虫、清除营养并对环境变化做出反应。由数千个物种组成的微生物群使用由复杂的调控网络解释的大型化学语言相互作用，并与植物相互作用。在这项工作中，我们开发了模块化的界间通信通道，使细菌能够将环境刺激传递给植物。我们在恶臭假单胞菌和肺炎克雷伯菌中引入了一种“发送装置”，当传感器或电路的输出打开时，它会产生小分子对香豆酰高丝氨酸内酯（pC-HSL）。这种分子触发植物中的“接收器”来激活基因表达。我们在水培和土壤中生长的拟南芥和马铃薯中验证了该系统，通过交换处理不同刺激（包括 IPTG、aTc 和砷）的细菌来证明其模块化。细菌和植物之间的可编程通信通道将使微生物哨兵能够向农作物传输信息，并为设计人工联合体提供基础。
植物HSL信号接收器官
植物接收器应检测特定的 HSL 并通过生成转录输出进行响应；换句话说，激活启动子（图1c）。接收器设计基于 Quatrano 及其同事开发的植物启动子支架，该支架已被证明在不同植物中具有功能，包括拟南芥 90 。该启动子基于最小的 35S 基序 (P m35S )，除非激活剂结合上游，否则该基序处于非活性状态。该支架已用于创建 3-氧辛酰-L-HSL (OC8-HSL) 诱导型启动子，可与其他 HSL 90 发生交叉反应。在这里，根据我们在哺乳动物细胞 91 中的工作，我们改变了这种设计，将四个操作子之间的间距从10 bp减少到2 bp，并在操作子下游添加了TMVΩ翻译增强子 92 启动子以增加表达。从群体感应系统中选择了四种原核调节因子：1. LuxR AM （费氏弧菌），2. CinR AM2 （豆根瘤菌），3. LasR AM （铜绿假单胞菌）和 4. RpaR AM （沼泽红假单胞菌）。每个调节器及其同源运算符都是从我们之前进化的一组中收集的，以提高它们的正交性和动态范围（由 AM 表示） 21,93 。为了使调节因子在植物中发挥功能，它们的 N 末端与 SV40 核定位信号 (NLS)、激活结构域 (VP16) 和 6 G 柔性接头融合（图 1d） 94 。调节子受强 35S 启动子、TMVΩ 翻译增强子和 T OCS 终止子的控制。该装置是通过将报告基因表达盒与输出启动子结合起来构建的（方法）。调节因子组成型表达为单体，在 HSL 存在的情况下，它们二聚化并与输出启动子结合，导致绿色荧光蛋白 (GFP) 表达。该盒包含草胺膦乙酰转移酶基因，以产生对除草剂草胺膦(PPT)的抗性作为选择标记。使用农杆菌花浸法（方法）将构建体转化到拟南芥中。经过多轮除草剂选择，分离出所有抗性后代，鉴定出每个受体的多个纯合拟南芥品系。野生型拟南芥和含有 pC-HSL 受体的拟南芥之间没有观察到显着的表型差异（图 1e、f）。
随后测试含有接收器的拟南芥品系对其同源 HSL 的反应能力。按照 Shank 和同事的方案（方法） 95 ，种子在生长室的琼脂板上发芽并生长 7-12 天，然后转移到水培系统中。该系统允许植物根部在 24 孔板中暴露于均匀的诱导剂浓度。我们为每个 HSL 接收者筛选了 4-9 个植物品系。作为活性的初始筛选，我们添加了 100 µM 的 HSL 诱导剂：N-3-氧代己酰基-L-高丝氨酸内酯 (OC6-HSL) 用于表达 LuxR 的细胞系，3-羟基十四烷酰基-高丝氨酸内酯 (OHC14-HSL) 用于表达 LuxR 的细胞系。CinR 表达系，N-3-氧代十二酰基-L-高丝氨酸内酯 (OC12-HSL) 用于 LasR 表达系，或 pC-HSL 用于 RpaR 表达系。在水培板中诱导 24 小时后，使用共聚焦显微镜观察根组织中的荧光（方法）。为了量化荧光，我们计算了根组织切片的平均像素强度（MPI）。含有 pC-HSL、OC12-HSL 和 OHC14-HSL 受体的拟南芥品系分别显示 180 倍、40 倍和 7 倍的诱导（图 2a、b）。OC6-HSL 接收器没有产生任何功能线，因此没有进一步研究。在测试 pC-HSL 诱导的 9 个独立品系中，有 7 个是活跃的，我们选择其中拟南芥 315_14_5 进行进一步表征。我们发现GFP仅在成熟组织中表达，分生组织中没有GFP（图2a）。使用 RT-qPCR，我们发现与叶和茎组织相比，GFP 主要在根组织中表达。
测量了 pC-HSL 和 OC12-HSL 接收器的完整响应函数（图 2b）。最低检测限为100 nM pC-HSL，比R. palustris 中RpaR的检测限高一个数量级。在缺乏诱导剂的情况下，表达比野生型拟南芥高5倍。测试含有 pC-HSL 受体的植物是否对非同源 HSL 做出反应（正交性）（图 2c）。与之前一样，用 100 µM 的每种 HSL 培养和诱导植物 24 小时。没有观察到非同源 HSL 的诱导，因为背景荧光与缺乏诱导物的植物无法区分。这与这些分子不结合进化的RpaR AM的观察结果一致。前体对香豆酸盐不会诱导受体，这与之前对RpaR的研究一致。
测试了 pC-HSL 受体对土壤中生长的植物的诱导能力（图 2d、e）。将种子灭菌并在琼脂平板上发芽以达到均匀发芽。第一片叶子出现后，将植物转移到补充有肥料的 1:3 蛭石：土壤非无菌混合物中，并在生长室中生长 10 天，然后在土壤中原位诱导。通过将补充有 100 µM pC-HSL 的 1 mL 水直接移液至植物-土壤界面来诱导植物。我们估计整个土壤中 pC-HSL 的浓度为 260 nM，但由于是通过浇水添加的，因此预计地表附近的浓度会更高。然后将植物在生长室中再生长 小时，然后用水清洗根部以准备成像。使用共焦显微镜测量 GFP 的荧光。如水培实验中所观察到的，仅在存在 pC-HSL 的情况下在含有 pC-HSL 受体的植物的根组织中观察到 GFP。
细菌 PC-HSL 信号发送器
土壤细菌经常产生酰基-HSL。例如，恶臭假单胞菌 IsoF 和 WCS358 产生 3OC12-HSL。为了确认我们的菌株不产生酰基-HSL 或 pC-HSL，我们对恶臭假单胞菌 KT2440 和肺炎克雷伯菌的基因组进行了 BLAST 搜索。这两个物种都没有任何与 RpaI、LuxI、LasI、CinI 或 TraI 具有显着序列相似性的蛋白质。通过测试野生型菌株是否可以诱导拟南芥 pC-HSL 受体，进一步通过实验验证了这些物种无法产生 pC-HSL。发送器设备必须将传感器或电路的转录输出转换为通信分子的产生，并达到接收器可检测的浓度。设计了一个三基因操纵子将内源酪氨酸转化为pC-HSL（图3a）。使用沼泽红假单胞菌 (rpaI) 的 pC-HSL 合酶基因、球形红杆菌 (tal) 的酪氨酸解氨酶基因和烟草 (4cl) 的 4-香豆酸辅酶 A 连接酶基因构建生物合成途径。将操纵子携带红色荧光蛋白基因（mCherry），以便可以监测诱导情况。
最初，为了测试该途径是否产生足够的 pC-HSL 来理论上开启植物受体，将生物合成操纵子置于 pBBR1-ori 质粒上的强组成型启动子 BBa_J23100 的控制下。在对植物进行测试之前，我们使用经过改造的大肠杆菌构建了一个替代接收器，以响应 pC-HSL。大肠杆菌基因组经过修饰，含有由组成型启动子控制的 rpaR AM 和驱动黄色荧光蛋白 (YFP) 表达 21,100 的 P rpaR*A （大肠杆菌MG1655 sTT658，补充表 4）。使用流式细胞术测量 YFP 的荧光。该报告菌株表现出 pM 敏感性，并在 3 小时后在 10 nM pC-HSL 下完全诱导。为了估计发送细胞产生的 pC-HSL 浓度，我们收集了在补充有 100 µM 对香豆酸盐的 MS 培养基中生长 24 小时后的上清液，并用它来诱导大肠杆菌 pC-HSL 接收菌株。利用这些数据，我们估计恶臭假单胞菌在拟南芥存在下产生的浓度为 1.5 ± 0.2 µM pC-HSL。当肺炎克雷伯菌在拟南芥存在下在 MS 培养基中培养 24 小时时，pC-HSL 产量估计为 0.30 ± 0.07 µM。
细菌到植物的信号传递
然后我们测试了产生pC-HSL的细菌诱导拟南芥pC-HSL受体的能力（图3a）。最初，使用组成型产生pC-HSL的菌株（恶臭假单胞菌pTT337和肺炎克雷伯菌pTT337）。植物在固体琼脂上发芽并添加到24孔板中。细菌在LB培养基中生长过夜，然后洗涤并稀释到含有植物的孔中的MS培养基中。共培养物生长 24 小时，并对根进行成像（图 3b）。当与恶臭假单胞菌 pTT337 一起培养时，拟南芥 pC-HSL 受体被诱导 30 倍，与产生 pC-HSL 的肺炎克雷伯菌 pTT337 一起培养时，诱导了 50 倍，但与野生型细菌一起培养时，未诱导（图 3c、d、3）。固体琼脂中的诱导产生了与水培系统类似的结果。为了测试植物和细菌之间通讯的非特异性干扰，我们随后测试了接收器对 pC-HSL 的反应在野生型恶臭假单胞菌存在的情况下是否发生变化，这可能是通过对 pC-HSL 的非特异性反应而发生的。细菌。当细菌存在时，没有观察到响应函数的显著变化。
然后测试了在土壤中传输信号的能力（图3e、f）。通过将细菌稀释到补充有 100 µM 对香豆酸盐的 PBS 中至 OD 600 = 0.1，然后将其分配到土壤中，或者通过浸入无菌拟南芥 pC-HSL 接收器，将细菌引入土壤中将种子放入恶臭假单胞菌过夜培养物中，然后播种到土壤中。在无菌土壤中，通过种子接种和浇水，我们观察到当系统接种恶臭假单胞菌 pTT337 时，与恶臭假单胞菌 WT 相比，pC-HSL 受体的诱导分别是 32 倍和 39 倍（图 3e）。在非无菌土壤中，观察到较小的 17 倍诱导。通过在无菌和非无菌土壤中浇水接种的植物的全根成像显示，GFP在靠近表面的成熟根组织中表达。
产生 pC-HSL 的细菌对马铃薯的诱导
将 pC-HSL 接收器装置移至马铃薯 (S. tuberosum)。pC-HSL受体构建体（pTT315-Hyg）用于构建S. tuberosum 315。携带pC-HSL接收器导致鲜茎和干茎重量小幅下降，叶绿素含量指数小幅增加，但对表型没有显着影响。通过向水培系统中的植物添加 pC-HSL 来测量马铃薯 pC-HSL 接收器的响应。24小时后，从根组织中分离出RNA，并通过qRT-PCR对gfp转录进行定量。由于 GFP 表达较低，因此使用 qRT-PCR 代替共聚焦显微镜。尽管如此，用 100 µM pC-HSL 诱导马铃薯 pC-HSL 受体会导致 gfp 转录本上调 10 倍。用细菌发送者（恶臭假单胞菌 pTT337）诱导马铃薯 pC-HSL 接收者导致 gfp 转录物上调 6 倍。
工程菌的模块化传感与信号处理
通过将pC-HSL接收器植入植物体内，并更换细菌中的传感器，可以使同一植物感知不同的信号。多个传感器可通过基因电路整合，执行逻辑运算并控制pC-HSL发送器，从而将信号传递给植物。
证明模块化：构建了对不同化学物质响应的P. putida菌株，使用IPTG和aTc作为诱导剂，证明了传感器的动态范围，并展示了pC-HSL发送器的激活效果。
细菌哨兵用于砷检测：构建了用于检测砷的传感器，并在P. putida和K. pneumoniae中测试了其响应能力。连接到pC-HSL发送器后，这些菌株能够在植物根部诱导GFP表达，证明了其作为砷检测哨兵的可行性。
通过在P. putida中实现OR门逻辑电路，展示了细菌可以通过传感器的逻辑整合来调节植物的响应。在根系相关细菌中构建电路，可以使植物执行计算功能。
多重细菌哨兵传递信息：演示了多个细菌哨兵通过相同的通信通道传递信息的能力。不同传感器菌株混合后，对植物的接收器进行诱导，证明了“模糊OR”逻辑运算的执行。
总结来说介绍了通过工程菌株实现的模块化传感和信号处理技术，并展示了在植物-细菌系统中对不同污染物（如砷）的检测和响应的实际应用及其逻辑整合能力。
根际互作生物学研究室 简介
根际互作生物学研究室是沈其荣院士土壤微生物与有机肥团队下的一个关注于根际互作的研究小组。本小组由袁军教授带领，主要关注：1.植物和微生物互作在抗病过程中的作用；2 环境微生物大数据整合研究；3 环境代谢组及其与微生物过程研究体系开发和应用。团队在过去三年中在 Nature Communications，ISME J，Microbiome，SCLS，New Phytologist，iMeta，Fundamental Research， PCE，SBB，JAFC（封面），Horticulture Research，SEL（封面），BMC plant biology等期刊上发表了多篇文章。欢迎关注 微生信生物 公众号对本研究小组进行了解。
撰写：刘潇予
修改：文涛
排版：刘炜烨
审核：袁军 团队工作及其成果 （点击查看）
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小组成员文涛：taowen@njau.edu.cn等
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