链霉菌 Streptomyces setonii WY228 通过VOC调节植物生长并增强盐胁迫耐受性

概要总结

放线菌因其能够产生大量次级代谢物而闻名，这些次级代谢物在抗生素发现、生物防治和植物生长调节中具有重要应用。这些次级代谢物包括可扩散的化合物和挥发性化合物。微生物挥发性有机化合物（VOCs）是一类具有低分子量（<300 Da）和高蒸气压的化学分子，主要包括醇类、芳香化合物、酮类、萜烯、有机酸、硫化合物和烷烃，结构非常多样。这些VOCs可以通过空气、水和土壤轻松扩散，作为抗病原体和植物生长促进剂在没有物理接触的情况下在长距离内发挥作用。这些化合物在微生物-微生物和植物-微生物互作中作为重要的空气信号分子。自从2003年发现由枯草芽孢杆菌GB03产生的挥发性物质（如2,3-丁二醇和乙偶姻）能够促进拟南芥的生长以来，微生物VOCs已成为植物-微生物互作研究的焦点。后续研究报告了微生物VOCs在对抗植物病原体、促进植物生长、保护植物免受非生物胁迫和诱导系统抗性方面的能力，展示了其在农业生物技术中的巨大潜力。研究主要集中在细菌和真菌上，较少涉及放线菌门。

链霉菌属是放线菌门中的一个属，包含了大量已发表的物种，至今已报道超过900个物种。这个属在土壤中普遍存在，特别是在内生和根际环境中，许多链霉菌菌株表现出溶解无机和有机磷、产生铁载体和分泌1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的能力，因此许多菌株是高效的植物生长促进剂。土壤盐渍化是限制植物生长和发育的主要非生物胁迫，常导致根系发育不良、早衰、作物质量下降和病害易感性增加。因此，改善盐渍土壤是农业中的关键挑战。一些链霉菌种被报道可以缓解植物的盐胁迫。例如，链霉菌JCM 3373通过分泌吲哚-3-甲醛提高了大豆根系发育和胁迫响应基因的表达。耐盐内生菌链霉菌KLBMP5084被记录通过调节与盐胁迫耐受性相关的生理、生化和基因表达途径来提高番茄的耐盐性。因此，链霉菌种及其代谢物在保护植物免受非生物胁迫和改善土壤质量方面具有巨大潜力。

在过去的二十年中，链霉菌产生的VOCs被报道具有多种生物和生态功能，包括在病害抑制土壤中控制病原体、促进植物生长、生物控制真菌和线虫、收获后食品存储熏蒸、介导种间互作以及吸引和杀死昆虫。目前，关于链霉菌产生的VOCs的研究主要集中在抗真菌活性和挥发物分析上。然而，大多数链霉菌在自然界中产生的VOCs的组成、生物活性、生理和生态功能仍不清楚。目前，仅有少数例子说明了它们对植物生长促进的影响。本研究探讨了从药用植物牛蒡中分离出的九株内生链霉菌产生的挥发物对植物生长的积极影响，并通过顶空固相微萃取和气相色谱-质谱（HS-SPME/GC-MS）分析了链霉菌WY228菌株的挥发物成分，证明了WY228菌株的挥发物主要通过释放长链萜烯和2-乙基-5-甲基吡嗪化合物介导植物生长。我们还通过基因组测序和拟南芥的转录组测序和突变体实验，探讨了这些挥发物介导的植物生长促进机制。研究结果表明，WY228挥发物通过激活植物生长素和乙烯信号传导调节根系发育，并通过激活脱落酸信号和MYB75转录因子促进花青素合成，从而提高植物的盐胁迫耐受性。这些发现揭示了内生链霉菌WY228菌株挥发物的生态功能及其在农业中调节植物生长、发育和产量的潜在生物技术应用。

挥发物促进拟南芥幼苗生长和盐胁迫耐受性

从牛蒡组织中获得了九株内生链霉菌菌株，通过系统发育分析确定它们是不同的物种（图1）。特别地，由菌株WY228产生的挥发物显著增强了拟南芥的生长，表现为幼苗的新鲜重量和根重量增加。经过10天的共培养，WY228的挥发物显著增加了拟南芥幼苗的新鲜重量和侧根数量，呈现出剂量依赖性（图2A-C）。随着暴露时间的延长，处理组幼苗显示出更长的根毛（图2D），新鲜重量和侧根数量的增长超过对照组的1.3倍（图2E-F）。此外，WY228的挥发物还提高了叶片总叶绿素和根部总黄酮含量，分别增加了29.73%和85.07%（图2G-H）。

在盐胁迫条件下（50 mM和100 mM NaCl），挥发物处理显著改善了幼苗的生长，新鲜重量分别增加了38.46%和57.14%，根重量分别增加了78.26%和113.33%。使用Ba(OH)₂捕捉CO₂的实验表明，WY228的挥发物主要通过VOCs促进植物生长，而不是通过CO₂释放。

总的来说，WY228的挥发物显著促进了拟南芥幼苗的生长，提高了其对盐胁迫的耐受性。这些结果表明，链霉菌WY228通过释放挥发物对植物生长和抗盐能力具有重要的促进作用。

挥发物诱导的植物生长和发育的长期效应

我们评估了短期暴露于WY228挥发物的植物幼苗在盆栽实验中的长期生长和发育情况。处理过挥发物的拟南芥幼苗被移植到土壤中，继续培养7天后，表现出比对照组更好的生长（图3A）。到第28天，经过WY228挥发物处理的植物生长和发育明显优于未处理的对照组（图3B）。这些植物的荚果数量、花茎长度和新鲜重量分别增加了194.44%、78.02%和122.22%（图3C-E）。

我们还评估了WY228挥发物对微型番茄（Micro-Tom）果实产量的影响。经过10天的挥发物处理后，番茄组织培养幼苗的生长显著增强，特别是细根数量增加了204.55%。处理过挥发物的番茄幼苗在开花时间上明显早于未处理的植物。在土壤中生长76天后，处理过的番茄幼苗显示出更多且更密集的细根，并且产生的果实数量更多，成熟时间早于对照组。虽然每株番茄的果实数量没有显著增加，但总果实重量显著从19.21克增加到55.94克，产量提高了191.20%。这些结果表明，在幼苗阶段经过WY228挥发物处理可以显著促进植物生长、加速开花时间，并在成熟阶段提高果实产量。

菌株WY228挥发物分析及纯挥发物的植物生长促进效应

为确定特定的挥发性化合物成分，我们收集了WY228在ISP-2琼脂培养基上培养10天的顶空气体，并使用顶空固相微萃取和气相色谱-质谱（HS-SPME/GC-MS）进行了分析。通过主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）的综合分析，将WY228菌株的挥发物与培养基对照进行了比较，共鉴定出144种挥发物，这些挥发物在WY228培养物中的丰度至少是对照组的2倍（p < 0.05）。这些挥发物被分类为酮类、萜类、吡嗪类和醇类等。其中，长链萜烯类化合物占总化合物的50%以上，地霉素和2-乙基-5-甲基吡嗪是最丰富的，分别占总量的33.58%和15.74%。

为评估这些检测到的挥发物对植物生长的贡献，我们将拟南芥幼苗暴露于市售合成的地霉素、2-乙基-5-甲基吡嗪和长叶烯，在不同浓度（100 nM至1 mM）下进行测试。结果表明，地霉素对拟南芥生长没有显著影响（图4A）。然而，2-乙基-5-甲基吡嗪和长叶烯在各种浓度下显著促进了幼苗生长，增加了新鲜重量和根重量（图4B-C）。特别是，2-乙基-5-甲基吡嗪在最低测试浓度（100 nM）下表现出更强的植物生长促进效应，而长叶烯在较高浓度（100 μM和1 mM）下效果更好。

为了进一步验证这些挥发物在植物生长中的作用，我们在ISP-2琼脂培养基中添加了磷霉素（一种长链萜烯合成抑制剂）以进行共培养实验。结果显示，抑制长链萜烯合成显著抑制了挥发物介导的植物生长促进活性，尤其是减少了拟南芥的叶面积和侧根数量（图4D-F）。通过抑制长链萜烯的合成，七种长链萜烯类挥发物（地霉素、顺-卡拉敏、β-卡德烯、γ-穆罗烯、α-卡拉可烯、β-香叶烯、（+）-瓦伦烯和长叶烯）消失。这些发现强调了由WY228产生的长链萜烯类挥发物在调节植物生长和发育中的重要作用，确认了它们在这一生物过程中的主要调节作用。

菌株WY228的植物生长促进特性和功能基因组挖掘

为了阐明菌株WY228的植物生长促进机制，我们评估了其生长促进特性，并进行了基因组测序和分析。结果显示，WY228具有多种植物生长促进能力：

吲哚-3-乙酸（IAA）生产：WY228能够合成天然植物生长激素IAA，这在植物中由色氨酸合成。

铁载体生产：菌株能够产生铁载体，这对于植物的铁吸收和利用至关重要。

ACC脱氨酶生产：菌株能够产生1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶，这有助于降低植物体内的乙烯水平，从而促进植物生长。

固氮能力：菌株能够在无氮培养基上生长，表明其具有固氮潜力。

溶解无机磷：菌株能够溶解磷酸钙（Ca3(PO4)2），这有助于植物吸收磷。

由菌株WY228分泌的萜类挥发物是主要的植物生长调节剂

研究发现，萜类是由菌株WY228产生的主要挥发性成分。通过进一步的基因组注释，使用KEGG数据库，我们鉴定出WY228基因组中编码三种萜烯合成家族基因，这些基因被注释为地霉素合酶和萜烯环化酶。KEGG通路分析显示，WY228具有通过甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸（MEP）/DOXP通路合成长链萜烯和三萜烯的能力。

为了探索这些挥发物对植物生长的影响，我们在WY228共培养系统中添加了磷霉素（一种MEP通路的竞争性抑制剂）以抑制萜烯合成。结果表明，挥发物介导的植物生长促进活性显著下降，拟南芥的叶面积和侧根数量明显减少（图4D-F）。被抑制的长链萜烯合成导致七种长链萜烯类挥发物消失：地霉素、顺-卡拉敏、β-卡德烯、γ-穆罗烯、α-卡拉可烯、β-香叶烯、（+）-瓦伦烯和长叶烯（表1）。这些结果表明，WY228产生的长链萜烯类挥发物在调节植物生长和发育中起着至关重要的作用，确认了它们作为主要调节剂的地位。

菌株WY228挥发物诱导的植物转录变化

为了探讨挥发物介导的植物生长促进的分子机制，我们对暴露于WY228挥发物10天的拟南芥幼苗进行了转录组测序。结果显示，在根中鉴定出291个差异表达基因（DEGs）（137个上调，154个下调），在茎中鉴定出154个DEGs（96个上调，58个下调）。基因功能分类显示，Gene Ontology（GO）注释将这些DEGs分类为40个根部和38个茎部的功能术语，包括生物过程、细胞组成和分子功能等类别，如细胞和代谢过程、对刺激的响应和生物调节。类同源基因组（COG）数据库注释预测，根部DEGs主要涉及次级代谢物的生物合成、转运和分解代谢，以及防御机制，而茎部DEGs则主要与翻译后修饰、蛋白质周转和伴侣蛋白相关。

KEGG通路富集分析显示，在根部，挥发物上调的基因显著富集于花青素生物合成通路。关键DEGs包括在根部检测到的四个参与植物激素信号传导通路的DEGs，包括编码生长素响应蛋白IAA5、GH3家族蛋白、脱落酸（ABA）响应元件结合因子ABF4和ABA受体PYL6的基因。AUX/IAA和ABF4在暴露于挥发物后表现出上调表达。与乙烯响应和生物合成相关的DEGs主要表现为下调，包括六个AP2域转录因子和ACC合成酶基因（ACC是乙烯的前体）。

在暴露于挥发物的根部，上调的DEGs与黄酮和花青素生物合成有关，包括转录因子MYB75（上调4.4倍），已知其是花青素积累的正调控因子。其他受影响的代谢通路包括氮代谢、碳代谢和氨基酸代谢。在碳代谢中，编码6-磷酸葡糖酸内酯酶和核酮糖双磷酸羧化酶的基因上调，而编码异柠檬酸裂解酶的基因下调。在氮代谢中，编码硝酸盐转运蛋白NRT2.1的基因上调，根组织中编码硫酸盐转运蛋白SULTR1.3的基因上调。氨基酸代谢中的DEGs也上调，包括两个主要的载体超家族蛋白。抗氧化防御方面，编码谷胱甘肽S-转移酶和过氧化物酶的基因在挥发物处理后的根部上调。这些发现揭示了WY228挥发物通过多种基因和代谢通路的调控，显著影响植物的生长和应激响应。

生长素和乙烯在挥发物介导的拟南芥生长中的作用

为了探讨挥发物介导的拟南芥生长中生长素和乙烯的参与，我们进行了相关的实验分析。结果表明，WY228挥发物处理后的拟南芥幼苗中，与生长素和乙烯信号传导相关的多个基因表达发生显著变化。在生长素方面，生长素响应基因（如IAA5和GH3家族基因）在根部显著上调，这表明生长素信号传导途径在挥发物介导的植物生长促进过程中起关键作用。生长素响应蛋白和生长素诱导基因的上调，进一步证实了生长素在根系发育中的重要作用。在乙烯方面，乙烯信号传导途径中的关键基因（如ACC合成酶基因和多个AP2/ERF转录因子）在根部和茎中的表达显著下调。ACC是乙烯的前体，其合成酶基因的下调意味着乙烯的合成受到抑制。乙烯响应基因的下调进一步表明乙烯信号在挥发物介导的生长促进过程中可能受到负调控。

这些结果表明，WY228挥发物通过调节生长素和乙烯信号传导途径，促进拟南芥的生长。生长素信号的上调促进了根系发育和植物生长，而乙烯信号的下调可能减少了乙烯对植物生长的抑制效应，从而整体上增强了植物的生长表现。

ABA信号传导和花青素生物合成在挥发物介导的拟南芥盐胁迫耐受性中的作用

为了研究挥发物介导的拟南芥盐胁迫耐受性中的关键机制，我们重点分析了脱落酸（ABA）信号传导和花青素生物合成途径。实验结果显示，暴露于WY228挥发物的拟南芥幼苗中，与ABA信号传导相关的基因显著上调。例如，ABA响应元件结合因子ABF4和ABA受体PYL6在根部表现出明显的上调表达。这表明，ABA信号传导在增强植物盐胁迫耐受性方面起到了关键作用。此外，与花青素生物合成相关的基因，如MYB75转录因子，也在暴露于挥发物的植物中显著上调。MYB75是花青素积累的正调控因子，其上调表达导致花青素合成增加。这些花青素不仅具有抗氧化功能，还能够增强植物的抗胁迫能力。

总的来说，WY228挥发物通过激活ABA信号传导和花青素生物合成途径，显著提高了拟南芥的盐胁迫耐受性。这些结果表明，ABA信号和花青素在挥发物介导的植物胁迫响应中发挥了重要作用，进一步揭示了微生物挥发物在植物适应环境胁迫中的潜在机制。