Purpureocilium lilacinum和Penicillium chrysogenum降解重油污泥中烃类及修复土壤潜力

概要

重油污泥作为一种高危固体废物，对生态环境存在潜在的污染风险。石油烃的微生物降解是控制油泥环境污染的新兴策略。从中国西北新疆塔河油田收集的稠油污泥中分离到两种烃降解真菌，命名为 HF 和 HQ。根据形态学分析和基因测序，HF和HQ分别被鉴定为Purpureocilium lilacinum和Penicillium chrysogenum。当补充少量额外的碳源（可溶性淀粉）和氮源（酵母提取物）时，HF 和 HQ 能够生物降解油泥中的碳氢化合物。真菌处理（30 天）后，根据气相色谱-质谱分析，各种碳氢化合物成分的相对丰度以不同的模式变化。HF对环烷烃、正烷烃、芳烃和异烷烃的平均降解率分别为100.0%、21.2%、15.1%和14.5%。HQ 对烃类组成表现出相反的影响，正烷烃减少 (1.3%)，环烷烃、芳烃和异烷烃增加 (分别为 82.6%、10.2% 和 11.9%)。改性油污泥中约 15.3% 和 7.6% 的石油烃分别被 HF 和 HQ 去除。研究结果为P. lilacinum HF和P. chrysogenum HQ作为候选碳氢化合物降解剂在油泥污染土壤生物修复中的应用提供了经验证据。

烃类降解真菌的筛选与鉴定

对新疆塔河油田油泥进行富集培养，得到两种烃降解真菌，命名为HF和HQ。两种真菌都能以油泥作为唯一碳源生长（图1a）。它们降解油污泥中碳氢化合物的能力通过较大的菌落直径得到了初步证明，在 14 天时菌落直径平均达到 50 毫米（HF）和 58 毫米（HQ）。两种真菌的菌落形态和细胞微形态明显不同（图2）。菌株HF形成圆形菌落和浅紫色分生孢子。菌落表面平坦，有规则的放射状沟槽，质地粉状，无渗出物。菌株HQ形成圆形菌落和蓝绿色分生孢子。菌落的特征是平坦的表面、规则的放射状凹槽、绒毛状的纹理和大量的黄色渗出物。扫描电子显微镜显示，HF 菌株的分生孢子梗的特征是基部肿胀，顶端有轮生的圆锥形分生孢子瓶。菌株 HQ 的分生孢子梗的特征是三个轮生青霉，带有带有披针形分生孢子的管瓶。根据形态学观察，初步鉴定这两个菌株分别为紫霉属和青霉属。此外，本研究中获得的真菌序列与 NCBI-BLAST 数据库进行比对，以探索其分类学。菌株 HF 与 P. lilacinum 具有 100% 的序列相似性，菌株 HQ 与 P. chrysogenum 具有 99.82% 的序列相似性（图 2）。因此，菌株 HF 和 HQ 在分类学上分别被鉴定为 P. lilacinum 和 P. chrysogenum。

碳源和氮源优化

高分子量有机污染物，如长链正构烷烃和多环芳烃，在自然条件下不易生物降解。在许多情况下，添加外源有机物作为辅助碳源和能源可以促进有机污染物的生物降解。这个过程被称为共同代谢。为了提高油泥中顽固性碳氢化合物的生物降解效率，通过单因素实验筛选出紫紫青霉HF和黄青青霉HQ的最佳碳源和氮源。以油污泥为唯一碳源的真菌生长状况比以油污泥和少量可溶性淀粉为碳源的真菌生长要差（图1b）。HF菌株在添加甘露醇和可溶性淀粉的筛选培养基上的平均菌落直径最大（分别为56.00和55.50mm；表1）。当葡萄糖和蔗糖作为辅助碳源时，菌株HF的平均菌落直径较小（分别为52.00和52.00 mm）。当添加乳糖作为辅助碳源时，菌株HF的平均菌落直径仅为45.67 mm。使用可溶性淀粉和乳糖作为补充碳源观察到菌株 HQ 的最大平均菌落直径（分别为 68.50 和 64.00 mm）。当辅助碳源改为蔗糖和甘露醇时，菌株HQ的平均菌落直径分别减小至54.50和52.33 mm。以葡萄糖为辅助碳源的菌株HQ的平均菌落直径仅为42.00 mm。优化结果表明，在含油污泥的培养基上生长时，淡紫青霉HF的优选碳源为甘露醇和可溶性淀粉，黄青青霉HQ的优选碳源为可溶性淀粉和乳糖。因此，在生物降解试验中，选择可溶性淀粉作为两种真菌的最佳碳源。接下来，筛选了两个菌株的最佳氮源（表1）。菌株HF在以酵母提取物和蛋白胨为辅助氮源的筛选培养基上生长良好，形成较大菌落，平均生长直径分别为45.67和43.33 mm。使用(NH4)2SO4和NH4Cl作为辅助氮源观察到较小的菌落直径(平均直径分别为40.33和39.00mm)。以尿素为辅助氮源的菌落生长直径最小，为30.33 mm。对于菌株 HQ，基于 60.67、58.67 和 58.00 mm 的大菌落直径，使用 NH4Cl、(NH4)2SO4 和酵母提取物作为辅助氮源观察到良好的生长。使用蛋白胨观察到较小的菌落直径 (54.00 mm)。以尿素为辅助氮源时观察到的最小菌落直径为41.33 mm。优化结果表明，与矿物氮相比，淡紫假单胞菌 HF 更喜欢有机氮。酵母提取物是菌株 HF 的合适氮源，而 NH4Cl、(NH4)2SO4 和酵母提取物是 P. chrysogenum HQ 在含有油泥的培养基上生长的首选。因此，后续实验中选择可溶性淀粉和酵母提取物作为这两种真菌的最佳碳源和氮源。图 1. 两种真菌 HF 和 HQ 在矿物基础培养基上的生长 (a) 以油泥为唯一碳源（7 天，左；14 天，右）和 (b) 补充 0.2% 可溶性淀粉作为碳源额外的碳源（无淀粉，左；有淀粉，右；7 天）。

所选真菌的碘降解能力

在添加了0.2%可溶性淀粉和酵母提取物的生物降解介质上测定了P. lilacinum HF 和P. chrysogenum HQ 对油污泥中碳氢化合物的降解率30 d。补充表S1中，轻油的TPH降解率为33.81%（HF）和24.01%（HQ），比油泥的14.04%（HF）和10.06%（HQ）高出两倍多。与菌株 HQ 相比，菌株 HF 对轻油和油泥中碳氢化合物的生物降解能力显着较高（P < 0.05）。为了揭示两种真菌对各种碳氢化合物成分的生物降解能力，采用GC-MS分析了从油泥样品中提取的原始油/石油碳氢化合物（图3a）。空白对照中，轻油中不同烃组分的相对丰度由高到低依次为：烯烃（32.95%）>异烷烃（24.90%）>环烷烃（23.27%）>芳烃（11.46%）>正构烷烃（ 7.41%）。在HF处理中，所有碳氢化合物成分的降解率都相对较高。特别是，正烷烃完全降解（100%），其次是异烷烃（43.52%）、烯烃（40.45%）和环烷烃（33.42%）。芳烃的降解率最低，为28.38%。在 HQ 处理中，轻油中仅正构烷烃被降解（52.07%），同时还产生了其他碳氢化合物成分。芳香烃的相对丰度增加最多（69.72%），异构烷烃、环烷烃和烯烃的相对丰度也大幅增加（分别为37.20%、25.97%和24.38%）。对照组油泥烃类成分以正构烷烃（72.02%）为主，依次为异烷烃（11.89%）>芳烃（7.98%）>烯烃（6.55%）>环烷烃（图3b)。在HF菌株处理中，环烷烃的降解率达到100%，其次是正烷烃（21.20%）、芳烃（15.09%）和异烷烃（14.53%）。烯烃的比率最低 (9.16%)。菌株 HQ 只能生物降解正构烷烃 (1.33%)，并同时产生分析的其他碳氢化合物成分。环烷烃增加最多（82.59%），异烷烃的相对丰度，芳香烃和烯烃增长不太显着（分别为10.23%、11.89%和1.59%）。在油泥作为碳源的情况下，P. lilacinum HF 和 P. chrysogenum HQ 都生长旺盛（图 1b），碳氢化合物成分适度降解。

油泥中碳氢化合物的去除和生物降解

为了评估 P. lilacinum HF 和 P. chrysogenum HQ 对油泥污染土壤进行生物修复的潜力，进行了实验室模拟实验。经过 30 天的处理后，两种菌株都从改性油污泥中去除了部分碳氢化合物。菌株 HF 对碳氢化合物的去除效率是菌株 HQ 的两倍（15.31% vs. 7.62%，P < 0.05；图 4）。通过 GC-MS 分析了生物降解后油泥中的正构烷烃组分（表 2）。菌株HF的存在导致油泥中所有C9-26正构烷烃的不同程度减少，平均降解率为77.68%。当菌株HQ处理时，C9-17正构烷烃显着下降，平均降解率为31.77%，同时C19-26正构烷烃增加，平均生成率为5.58%。与 P. chrysogenum HQ 相比，P. lilacinum HF 可降解油泥中轻质、中质和重质馏分 (C9–C26) 中的多种碳氢化合物。