Integrated metabolomic and transcriptomic strategies to reveal adaptivemechanisms in castor plant during germination stage under alkali stress
DOI：10.1016/j.envexpbot.2022.105031
概要总结
本研究考察了不同浓度的碳酸氢钠（NaHCO₃）对蓖麻种子（cv. Fenbi 10）萌发及生理变化的影响。种子经过表面消毒后，在不同浓度的NaHCO₃（0, 50, 100, 和 150 mM）条件下培养10天。结果显示，随着NaHCO₃浓度的增加，种子的萌发率显著下降，150 mM NaHCO₃处理下萌发率最低，仅为27.78%。代谢组学分析显示，在50 mM NaHCO₃处理下，有31种代谢物显著变化；在100 mM NaHCO₃处理下，48种代谢物发生变化；而在150 mM NaHCO₃处理下，有113种代谢物出现显著差异。这些差异代谢物主要涉及氨基酸、脂质、核酸和有机酸等。转录组学分析表明，在50 mM NaHCO₃处理下检测到98个上调和40个下调的差异表达基因（DEGs）；100 mM NaHCO₃处理下检测到749个上调和96个下调的DEGs；150 mM NaHCO₃处理下检测到511个上调和183个下调的DEGs。这些DEGs主要参与光合作用和次级代谢途径。结果表明，蓖麻种子通过调节特定代谢物和基因表达以适应碱性胁迫条件。
研究方法
植物材料：试验选取山西省农业科学院经济作物研究所提供的均匀蓖麻种子（cv. Fenbi 10）
实验设计：先用5%次氯酸钠消毒10 min，蒸馏水洗涤3次。将30个表面灭菌的种子放入带有2层滤纸的培养皿中，用15mL的NaHCO3润湿滤纸（0，50，100和150mM）10天。每隔两天更换一次溶液。所有种子在24±1°C的生长室中生长，光周期为12小时。当胚根超过2厘米时视为萌发，并保存在-80°C。实验重复四次，结果相似。
实验方法及指标测定：无机离子(Na+和K+)含量的测定，丙二醛(MDA)和脯氨酸含量的测定，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定，转录组学分析，代谢组学分析。
碱胁迫下蓖麻种子萌发及生理变化
在所有NaHCO3浓度下均发生萌发(Table 1)。非碱条件下蓖麻种子的萌发率最高(80%)。种子萌发率随碱性的增加而降低(P < 0.05)。150 mM NaHCO3处理的发芽率最低，仅为27.78%，为对照的34.7%。
代谢物分析对蓖麻籽碱胁迫响应的差异
为了解蓖麻种子在代谢水平上的耐碱差异，采用LC-MS分析了蓖麻种子在不同浓度碱胁迫下的代谢物谱。通过正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)检测不同碱度处理和对照处理种子代谢产物的差异(图1)，若Q2大于0.4，则认为OPLS-DA模型有效。OPLS-DA评分显示不同碱度下蓖麻种子的萌发过程有显著差异。A1/CK、A2/CK和A3/ CK分别鉴定出31、48和113种差异代谢物。其中，氨基酸、脂质、核酸和有机酸在各碱处理下均发生了显著变化(图2)。
在本研究中，与对照(CK)相比，在50 mM NaHCO3处理下，31种代谢物(A1)发生了显著变化，其中29种代谢物增加，2种代谢物减少(图3)。
这些代谢物分为氨基酸及其衍生物(10个)、有机酸(7个)、核酸及其衍生物(5个)、脂质及其衍生物(3个)、生物碱(3个)、香豆素(2个)、激素及其激素衍生物(1个)。同时，上述代谢物被富集为精氨酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、丁酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、谷胱甘肽代谢和萜类骨架生物合成8条代谢物途径。
与对照组相比，在100 mM NaHCO3处理下，48种代谢物发生了显著变化(A2)，其中40种代谢物增加，8种代谢物减少(图3)。这些代谢物包括氨基酸及其衍生物(19)、脂质及其衍生物(9)、有机酸(9)、核酸及其衍生物(5)、生物碱(3)、维生素(2)、其他(1)(表3)。进一步证明，上述代谢物控制着16条代谢物途径，这些途径受到了显著影响。
值得注意的是，与对照相比，50、100和150 NaHCO3处理下，种子中一些代谢物的变化趋势不同，包括热谷氨酸、l -脯氨酸、亚麻苦素、l -谷氨酰胺、l -天冬氨酸、鸟嘌呤和鸟苷。对于氨基酸及其衍生物的亚麻苦素，在50 NaHCO3处理下，其丰度比对照降低了0.42倍，而在100和150 NaHCO3处理下，其丰度分别增加了1.65倍和2.35倍(表1)。此外，结果还表明，一些属于脂类及其衍生物的代谢物仅在150 NaHCO3处理下发生变化，如肉豆醇酸(3.0倍)、二十碳三烯酸(3.0倍)、亚油酸(2.0倍)和癸二酸(3.0倍)。
转录组分析对蓖麻籽碱胁迫响应的差异
为了揭示相关基因的表达谱，利用高通量测序平台建立了4个转录文库。对照组共检测到4884 M个raw reads(表2)。三种比较蓖麻种子的差异表达基因(DEGs)如图4所示，分别为A1/CK、A2/CK和A3/ CK。与对照相比，碱度最低(A1, 50 mM)的碱度上调了98个DEGs，下调了40个DEGs(图4a和B)。NaHCO3浓度为100 mM时，与对照相比，上调了749个DEGs，下调了96个DEGs。A3/CK组的DEGs低于A2/CK组，其中511个基因表达上调，183个基因表达下调。A1/CK处理包含137个生物过程，57个细胞过程组成和85个分子功能(图5A);A2/CK包括556种生物学过程，121种细胞成分和362种分子功能;A3/CK包括526个生物学过程，110个细胞成分和343个分子功能。
比较中特别下调的deg分别为22、489和252。进一步检查deg，三个比较中共有的deg为57，包括8个上调的deg和49个下调的deg(图4C)。
结果表明，A1/CK包含137个生物过程，57个细胞过程组分和85个分子功能(图5A);A2/CK包含556个生物过程、121个细胞组分和362个分子功能;A3/CK包含526个生物过程、110个细胞组分和343个分子功能。在A1/CK中，生物过程中的GO术语主要与“光系统I中的光合作用、光收集”、“脂质转运”和“蛋白质-发色基团连锁”相关(图5B)，而在A2/CK中，“对几甲壳素的响应”、“对真菌的响应”和“对真菌的防御响应”是生物过程中的主要GO术语(图5C)。在A3/CK中，生物过程中的主要GO术语是“光合作用”、“光系统I中的光合作用、光收集”，和“对Karrikin的响应”(图5D)。
然后，利用KEGG数据库分析了deg富集的多种途径。结果表明，三个比较的deg与光合作用和次生代谢密切相关(图6 A-C)。A1和控制之间的度被浓缩成“photosynthesis-antenna蛋白质”,“光合作用”和“类黄酮生物合成”(图6 A和D)。除了“photosynthesis-antenna蛋白质”和“光合作用”,A2 / CK的度也浓缩成“phenylpropanoid生物合成”和“植物-病原互作”(图6 B和E)。在A3 / CK,度被浓缩成“光合作用”,“photosynthesis-antenna蛋白质”,“phenylpropanoid生物合成”(图6 C、F)。
为了验证本研究RNA-Seq数据的可靠性，我们在三个比较(A1/CK、A2/CK和A3/CK)中随机选择4个deg进行RT-qPCR处理。这四个度是29200。如图7所示，基因表达值在0以上，说明基因被上调表达。RT-qPCR得到的3个比较中4个基因的表达趋势与本研究的RNA-Seq数据一致。因此，这表明我们研究中的RNA-Seq数据是高度可靠和准确的。
讨论
此研究中蓖麻种子的萌发率随碱度的增加而急剧下降，说明蓖麻种子的萌发受到Na+、高pH及其相互作用的强烈影响。大多数盐碱环境中的植物总是积累大量的Na+，从而降低细胞水势，同时抑制K+的吸收。结果表明，随着碱度的增加，Na+浓度增加，K+浓度降低，K+ / Na+比值随之降低，这可能是由于高pH对K+的吸收有抑制作用，影响细胞功能。
与氨基酸代谢相关的大部分DEMs在碱性盐处理下收集，这表明高浓度NaHCO3引发了氨基酸的大量转移。在轻度和中度碱胁迫下，种子氨基酸代谢相关DEMs与重度碱胁迫下的氨基酸代谢相关DEMs重合。这些结果表明蓖麻种子在碱性条件下必须动员氨基酸代谢。代谢组学数据显示，随着NaHCO3浓度的增加，诱导了碳水化合物的代谢。丁二酸、柠檬酸和乌头酸是低分子量有机酸，也是三羧酸循环的重要原料。进一步检测与TCA循环相关的基因发现，编码苹果酸脱氢酶的RcMDH被A3处理上调。这些综合结果表明，蓖麻种子通过提高TCA循环效率来响应碱盐胁迫，以提供更多的能量和代谢产物。
在此研究中，无论NaHCO3浓度如何，核苷酸生物合成中的DEMs都增加了。嘌呤和嘧啶的积累不仅参与生物能量过程，而且在种子萌发阶段为核酸合成提供前体。因此，蓖麻种子在碱盐胁迫下可以增加核苷酸的代谢产物，以保证种子的萌发。
根际互作生物学研究室 简介
根际互作生物学研究室是沈其荣院士土壤微生物与有机肥团队下的一个关注于根际互作的研究小组。本小组由袁军教授带领，主要关注：1.植物和微生物互作在抗病过程中的作用；2 环境微生物大数据整合研究；3 环境代谢组及其与微生物过程研究体系开发和应用。团队在过去三年中在 Nature Communications，ISME J，Microbiome，SCLS，New Phytologist，iMeta，Fundamental Research， PCE，SBB，JAFC（封面），Horticulture Research，SEL（封面），BMC plant biology等期刊上发表了多篇文章。欢迎关注 微生信生物 公众号对本研究小组进行了解。
撰写：刘浩男
修改：文涛
排版：刘炜烨
审核：袁军 团队工作及其成果 （点击查看）
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小组成员文涛：taowen@njau.edu.cn等
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