Natural plant disease suppressiveness in soils extends to insect pest control
DOI：10.1186/s40168-024-01841-w
研究背景
害虫和病原体导致全球主要农作物损失约20% 。在昆虫害虫中，谷物叶甲（Oulema melanopus，鞘翅目：叶甲科）取食多种野生和栽培草本植物，包括前五大作物之一的小麦，并且在欧洲、亚洲和北美被认为是一个重大威胁。由于气候变化导致的气温上升将扩大其地理范围并增强其对作物的影响，因此由O. melanopus引起的损失将会增加。目前对O. melanopus的控制主要依赖于化学杀虫剂的使用，尽管长期以来已有报道称通过内寄生蜂和昆虫病原线虫进行生物控制。尽管如此，由于化学杀虫剂对环境的有害影响，人们一直有压力减少其使用，这推动了开发环保和可持续的害虫缓解方法。
天然土壤抑病性已被观察到很长时间，它指的是某些土壤赋予植物对特定植物病原真菌、卵菌、细菌或线虫引起的疾病具有保护作用的能力。在某些情况下，土壤抑病性取决于土壤中存在的少数关键保护性微生物群体。其中一个最有名的案例是瑞士纳沙泰尔湖附近的土壤对黑根腐病病原体Thielaviopsis basicola的自然抑制性。这些土壤在1980年代首次被研究，并发现它们的疾病抑制性、物理化学特性和微生物组组成之间存在关系。更具体地说，含有蛭石粘土的土壤支持病原体抑制的假单胞菌属的增殖和活动。这些假单胞菌释放抗真菌化合物，有效地在土壤中与T. basicola进行拮抗，保护烟草作物。一些假单胞菌的代表也可以定居并用杀虫毒素杀死害虫。因此，存在于天然抑病性瑞士土壤中的细菌可能通过直接从土壤向昆虫传播杀虫细菌，或通过土壤微生物组介导的间接机制，导致植物防御的启动，从而保护植物免受真菌和昆虫害虫的侵害。尽管增加昆虫病原菌群体或微生物组管理已被提出作为减轻土壤中害虫发生的战略，但天然土壤对害虫昆虫的抑制性尚未有文献记录。
O. melanopus的微生物组由内共生菌如沃尔巴克氏体（Wolbachia）组成，以及其他可以被宿主植物显著影响的细菌，而植物本身可能受到土壤微生物组的影响，例如通过植物免疫反应的启动来抵御微生物和昆虫攻击。这已知是通过植物激素如茉莉酸和水杨酸[或氰苷化合物如亚麻苦苷和洛塔斯特林介导的。在禾本科植物中，苯并恶嗪（BXs）也是一类具有抗微生物和杀虫活性的主要植物防御分子。BXs是次级代谢产物，以稳定的葡萄糖苷形式储存在植物细胞的液泡中，细胞受损时释放，并转化为活性的不稳定的脱葡萄糖苷形式。小麦中最丰富的BX是DIMBOA，对一些昆虫具有很高的毒性。土壤微生物组也可以影响植物防御代谢，通过启动植物防御反应来抵御咀嚼叶片的害虫。因此，监测这三类代谢物的浓度可以提供洞见，了解天然土壤抑病性如何影响植物防御反应。在这项工作中，我们测试了疾病抑病性土壤是否也能保护植物免受昆虫害虫的侵害，通过研究O. melanopus与小麦在四种对T. basicola抑制水平不同的土壤中的相互作用。我们评估了昆虫幼虫死亡率和草食性、植物防御代谢物的变化，以及在不同土壤中生长的植物的土壤、根际、叶片和与植物相关的昆虫幼虫中的微生物组组成。我们的结果表明，表现出天然抑病性对抗土传植物病原体的土壤也可以通过一个复杂的土壤-植物反馈提供对食草昆虫的保护，涉及植物有益细菌的存在和系统性植物防御反应的启动。
土壤抑制作用在数十年后仍然存在
我们在瑞士纳沙泰尔湖地区收集了六种土壤（图1A），这些土壤在过去几十年中因其自然抑制由土壤病原体Thielaviopsis basicola引起的烟草黑根腐病的能力而闻名。我们重新评估了这些土壤自然抑制T. basicola感染烟草植物的能力。我们发现，以前被分类为导病性的土壤（C6, C10和C112）保持了这一特性，因为在接种了T. basicola的土壤中生长的烟草植物的病情严重程度（60-100%）显著高于未接种的土壤（图1B）。之前被识别为抑病性土壤的三种土壤（S16, S7和S8）产生了不同的结果。在S16土壤中生长的烟草植物在接种T. basicola后表现出显著较低的病情严重度（<25%），与导病的土壤相比。土壤S7表现出中间的抑制作用（图1B），病情严重度范围为25-75%，与S16和导病的土壤显著不同，这与以前的发现一致。未接种的S8土壤中的植物显示出与接种的导病土壤相似的病情严重度。在研究的六种土壤中，五种土壤的长期抑制或导病态得到了确认，选择了四种土壤，C10, C112, S7和S16，用于进一步分析。
土壤抑制作用增加昆虫死亡率并减少叶片损伤
研究评估了导病或抑病性土壤对谷粒叶甲O. melanopus幼虫的影响。在四种选定的土壤中种植的小麦植物上放置了幼虫11天，并每天评估它们的存活率（图2A）。C10导病土壤生产的幼虫死亡最少，与S16抑病性土壤形成显著差异，到第九天所有幼虫都已死亡（Cox模型，P = 0.0003，图2B）。C112和S7土壤与其他土壤没有显示出任何统计差异。此外，使用中点和终点的O. melanopus幼虫死亡率来计算死亡和存活幼虫的百分比。土壤S16在两个时间点上都有最高比例的死亡昆虫幼虫（90-100%），而C10有最低比例（35-65%，图2B）。在中点和终点之间，C112相比S7，可以看到死亡率的增加，可能支持S7是部分抑病性土壤的观点。尽管在C10土壤上取食的幼虫到第11天显示出最高的存活率，但仍有50%的幼虫死亡。即使在最导病的C10土壤中，这种看似高的死亡率也与之前观察到的O. melanopus幼虫的正常种群动态相一致。取食O. melanopus幼虫的叶片损伤区域显示出有无幼虫组之间的强差异（图2C），在暴露于食草的植物中观察到的平均损伤叶片面积约为30-60%，而对照组则少于10%。我们还观察到，在抑病性土壤中的平均损伤叶片百分比较低（<30%），与导病的土壤相比。条件之间在植物生长方面没有显著差异。
叶片中水杨酸介导的信号可能减少抑病性土壤中植物的压力
种植在抑病性土壤的植物(没有受到昆虫的袭击)有更高水平的SA，这减少看昆虫胁迫，预先保护植物，推测是微生物直接产生或者诱导植物防御信号。为了评估植物对O. melanopus幼虫存在反应，我们分析了四种土壤中叶片和根部的五种与防御相关的植物激素脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、茉莉酸异亮氨酸（JA-Ile）、12-氧-植物二烯酸（OPDA）和水杨酸（SA）。食草幼虫的存在显著增加了所有土壤中植物叶片中所有评估的植物激素浓度（图3A）。相比之下，除了ABA外，昆虫幼虫的存在对根部的植物激素浓度没有显著影响。茉莉酸前体OPDA和JA-Ile，这两种物质在植物面对昆虫食草时参与植物防御信号传导，在导病的C10土壤中含量最高，在高度抑制的S16土壤中含量最低（图3B, C）。同样，小麦叶片在S16土壤中对昆虫暴露的JA和JA-Ile水平变化较小，这表明植物压力较小。S16对照组的叶片中SA含量也显著高于其他对照组，表明这些植物在这种土壤中对生物威胁进行了预处理（图3D）。
在抑病性土壤中，与昆虫防御相关的苯并恶嗪水平受到抑制
还分析了叶片和根样品中六种与植物对昆虫损伤反应相关的苯并恶嗪（BXs），包括更活跃的DIMBOA及其储存形式DIMBOA-Glc。此外，还测量了两种氰苷，亚麻苦苷和洛塔斯特林。与植物激素不同，大多数BXs在叶片样品中的浓度不受O. melanopus幼虫的影响，无论使用哪种土壤。例外的是C10和C112土壤中的DIMBOA, HBOA-Glc，S16土壤中的DIMBOAGlc，以及S7土壤中的HMBOA-Glc（图4A）。植物叶片在S16和S7抑病性土壤中暴露于O. melanopus幼虫时，DIMBOA浓度呈降低趋势，与在导病土壤中的情况不同，这不能在储存形式DIMBOA-Glc中观察到（图4B, C）。同样，在S16和S7抑病性土壤中，DIMBOA水平在草食暴露后的变化显著低于在导病的C10和C112土壤中，后者在幼虫存在时DIMBOA浓度几乎翻倍（图4D）。虽然在没有昆虫的情况下，叶片中DIMBOA:DIMBOA-Glc的比率相似，但在所有土壤中，昆虫暴露组的DIMBOA相对于DIMBOAGlc的浓度增加，除了高度抑制的S16土壤（图4E）。在叶片中，DIMBOA-Glc和HDMBOA-Glc的浓度与昆虫死亡率呈显著正相关（Spearman，r > 0.36，P < 0.01，图4F, G），而叶片中DIMBOA的浓度与死亡率呈负相关（Spearman，r = -0.34，P = 0.0056）。
在抑病性土壤种植的植物上取食的昆虫微生物组失调
可以在ASV水平上做丰度前50的差异，这样是否可以聚焦到自己想要的属,是否可以得出自己关注的属能够解释群落50-60%的差异。
分析了四种土壤、小麦植物的根际和叶片微生物组，以及在这些植物上取食的O. melanopus幼虫的微生物组。系统地发现土壤和根际微生物组的扩增子序列变体（ASVs）更多，α多样性更高，而小麦叶片或O. melanopus幼虫微生物组的α多样性较低。基于Bray-Curtis差异，幼虫微生物组在不同土壤之间存在显著差异，S7和C112聚集在一起，与S16和C10相距较远（图5A）。在C10和S16土壤中生长的植物上取食的O. melanopus幼虫的ASVs差异丰度分析揭示了不同的Pantoea、Wolbachia和内共生菌（Enterobacterales）群体（图5B），这些群体贡献了超过~75%的幼虫微生物组（图5C）。在基于土壤类型的O. melanopus幼虫中，这三个属的相对丰度没有显著差异，除了在C112和S7土壤中生长的植物上的幼虫中内共生菌更丰富（图5C, D）。然而，在最具抑病性的S16土壤中，Wolbachia和其他内共生菌的中位相对丰度较低，与Pantoea的丰度较高相一致，反映了个别ASV变化（图5E），并开始了微生物组失调。
抑病性土壤中的根际微生物组抵抗害虫引起的破坏
四种土壤的微生物组基于Bray-Curtis差异显著不同（PERMANOVA，P = 0.0001），S16和C10之间的差异最大（PERMANOVA，P = 0.0072，图6A）。O. melanopus幼虫的叶片取食对任何土壤中小麦根际微生物组的整体组成没有显著影响（图6A）。在C10和S16根际中暴露于O. melanopus幼虫的植物的ASVs差异丰度分析揭示了几个细菌属的群体，包括在一种土壤中富集的Pseudomonas（图6B）。幼虫的存在也与C10和S16根际中某些Pseudomonas ASVs群体的富集相一致（图6C）。在S16根际中检测到Pseudomonas protegens的确切ASV序列匹配，幼虫和对照组之间没有差异。然而，P. protegens在这种土壤中生长的植物的叶片或任何其他土壤中均未检测到（图6D）。此外，不同土壤中根际相关属的模式也不同。例如，Herbaspirillum和Rahnella在C10土壤中未被检测到，而Streptomyces在这种土壤中更丰富（图6E）。对四种土壤中控制和幼虫暴露植物的根际微生物组的协方差网络分析显示，当幼虫存在时，导病的C10和C112根际网络的平均模块度显著降低，而高度抑制的S16根际网络没有变化（图6F）。S7根际呈现出中间水平，幼虫存在时平均网络模块度略有降低（图6F）。平均模块度的降低与边数（即ASVs之间的连接，补充图S7）的增加相一致。
讨论
在这里，我们测试了某些田地土壤对真菌病原体的自然抑制作用是否可以扩展到昆虫害虫。我们首先评估了瑞士纳沙泰尔湖附近22平方公里区域的著名瑞士土壤的抑制状态，这些土壤长期以来一直被认为能够抑制由T. basicola引起的烟草黑根腐病。我们选择了六种代表性土壤，这些土壤最初由Geneviève Défago及其同事在1980年代进行了表征，他们将抑制水平与土壤地质学联系起来。我们的发现证实了他们的结果，并记录了在所有但一个（S8）选定的田地土壤中，几十年来对黑根腐病的持续抑制水平。由于土壤S8之前被认为是抑病性的，其当前状态值得进一步研究。差异可能是由于可能与另一种根部病原体的共感染或土壤采样的深度引起的。
我们证明了土壤的内在抑制作用可以扩展到对食草害虫的控制，特别是谷粒叶甲O. melanopus。然而，抑制水平的变化，特别是土壤C10对害虫比对真菌病原体更致害性，以及土壤C112被适度地致害性，表明一些涉及的机制可能不同。这些瑞士土壤的抑制作用以前被归因于植物有益的假单胞菌。我们在最抑病性土壤S16中生长的植物的根际中确认了Pseudomonas protegens的存在，这是这种土壤中病原体抑制的候选者。相反，O. melanopus的微生物组由内共生菌和叶内生Pantoea组成，其相对丰度在不同土壤中相似。尽管如此，S16土壤中Pantoea群体的差异与Wolbachia和其他内共生菌的丰度较低相一致。昆虫内共生菌如Wolbachia参与复杂的互利互作，影响昆虫的适应性。S16昆虫中Wolbachia的丰度较低可能表明昆虫微生物组失调已经开始。
植物激素，特别是茉莉酸，参与植物对食草昆虫的免疫反应。我们观察到典型的茉莉酸介导的对食草的反应，小麦叶片暴露于O. melanopus幼虫时OPDA和JA-Ile水平增强。然而，在S16土壤中生长的植物积累的食草反应性植物激素较少，尽管这种土壤与最高的昆虫死亡率相关。这表明在S16土壤中生长的植物压力水平较低，尽管在第5天的昆虫死亡率与S7和C112土壤中的相似。我们观察到在S16土壤中生长的植物表现出明显的植物SA水平的预处理，这可能解释了食草压力的降低，并标志着对叶食昆虫的保护的开始。我们推测某些根际微生物组的成员可能通过直接产生SA或涉及复杂的植物防御信号传导，为植物的预处理做出了贡献。
同样，BXs是植物防御昆虫的重要化合物。我们只观察到少数BXs的浓度随食草而变化。DIMBOA及其储存形式DIMBOA-Glc是小麦中主要的BX，对昆虫有效，其浓度在C10和C112土壤中生长的植物叶片中显著较高。与茉莉酸一样，我们发现S16土壤中DIMBOA的积累较少。较高浓度的DIMBOA-Glc和HDMBOA-Glc与幼虫死亡率呈正相关，显示出典型的植物反应。然而，活性形式DIMBOA与死亡率呈负相关，表明DIMBOA不是导致增加幼虫死亡率的主要因素。同样，氰苷没有参与幼虫死亡率，这与之前对其他害虫甲虫的观察一致。
这些结果表明，在最具抑病性的土壤中生长的植物已经为抗性做好了准备，并即使在没有昆虫的情况下也表现出增强的反应，如SA水平较高所示。由茉莉酸和苯并恶嗪介导的较低压力反应可能是较高的幼虫死亡率和较低叶片损伤的表现。在这种情况下，植物不需要像在导病性土壤中那样产生强烈的食草相关反应。
我们分析了土壤、植物和昆虫的微生物组组成，以测试它们在天生控制害虫Oulema中的作用。实际上，根际微生物组的组成在导病性和抑病性土壤之间不同，C10和S16之间的差异最大。与植物生长促进和植物病原体抑制相关的几种植物有益属，如Herbaspirillum、Serratia和Rahnella，在C10根际中未被检测到。我们认为这些属有助于增强抑病性土壤中的昆虫害虫抗性，在S16中由额外的植物有益的P. protegens加强。几种机制可能有所贡献，包括植物防御的预处理，如SA所示。此外，小麦根际ASVs的协方差分析揭示了O. melanopus叶片寄生在导病土壤中对微生物组的破坏作用，表现为网络模块度的降低。类似的效果也与土传病原体一起观察到，强调了土壤微生物组对植物健康的重要性。然而，网络模块度在生长在抑病性S16土壤的植物的根际中保持不变。这一观察与在这种土壤中生长的植物对叶片取食Oulema的反应减弱、昆虫死亡率较高、对T. basicola疾病的抑制较高以及植物有益细菌的丰度较高相一致。
结论
土壤对地下真菌病原体的天生疾病抑制作用可以扩展到地上食草害虫。这是通过一个复杂的土壤-植物反馈网络介导的，涉及关键的植物有益的根际相关细菌和植物对食草昆虫反应的预处理。某些土壤对病原体和食草害虫的显著自然抑制作用展示了土壤微生物多样性在植物健康中的关键作用，并作为适合作为环境可持续作物保护策略中接种剂的有益细菌的储库。
文章的创新点
本文的创新点在于种在抑病性土壤中的植物变现出高水平的SA，预先启动了植物的防御系统，提前保护植物，等到昆虫胁迫来临时，植物将可以产生较少的JA和DIMBOA，便可达到高效率的抗虫效果（主要表现在昆虫死亡率和叶片受损面积）。
根际互作生物学研究室 简介
根际互作生物学研究室是沈其荣院士土壤微生物与有机肥团队下的一个关注于根际互作的研究小组。本小组由袁军教授带领，主要关注：1.植物和微生物互作在抗病过程中的作用；2 环境微生物大数据整合研究；3 环境代谢组及其与微生物过程研究体系开发和应用。团队在过去三年中在 Nature Communications，ISME J，Microbiome，SCLS，New Phytologist，iMeta，Fundamental Research， PCE，SBB，JAFC（封面），Horticulture Research，SEL（封面），BMC plant biology等期刊上发表了多篇文章。欢迎关注 微生信生物 公众号对本研究小组进行了解。
撰写：杨盛蝶
修改：文涛
排版：刘炜烨
审核：袁军 团队工作及其成果 （点击查看）
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小组负责人邮箱 袁军：junyuan@njau.edu.cn；
小组成员文涛：taowen@njau.edu.cn等
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