枯草芽孢杆菌SL44与霍氏肠杆菌Wu15联合防治植物病害

摘要

植物根际生长促进细菌（PGPR）的共培养已被提议作为农药的潜在替代品，用于控制作物中的真菌病原体，但其协同机制尚未完全了解。在本研究中，枯草芽孢杆菌SL44和霍马氏肠杆菌Wu15的联合使用可以降低胶孢炭疽菌和立枯丝核菌的密度，并增强菌丝体表面有益细菌的生长，从而减轻疾病的严重程度。同时，PGPR的应用通过调节其代谢物（如细胞外聚合物和几丁质酶）导致根际微生物群落的重组。这些代谢物对吸引和增强常规外围细菌、抑制真菌病原体和有效促进土壤健康具有积极作用。微生物群落结构的改善改变了土壤真菌群落的营养模式，有效地改变了土壤真菌群落的营养模式。减少腐养土壤的比例，减少真菌植物病害。PGPR 的某些组合有可能成为管理植物病原体的精确工具。

PGPR对植物果实的保护

图2描绘了炭疽杆菌和PGPR共接种后苹果表面的变化。感染炭疽杆菌的苹果在第3天后伤口部位出现了明显的菌丝生长。第15天后，苹果外皮部分腐烂，肉质部分完全腐烂，表明真菌病原菌已侵入果核。苹果表面出现的菌丝体数量随时间的变化如表S1所示。苹果表面接种SL44后，伤口中心无真菌菌丝生长，仅出现小腐斑。SL44在所有治疗中表现出最好的预防效果。苹果表面接种Wu15后，第5天，苹果表面出现少量真菌菌丝体。腐烂仅限于果实表面，第15天种子区域完好无损。由此可见，Wu15也起到了一定的预防作用。用SL44和Wu15处理的苹果，第9天苹果表面出现少量真菌菌丝，第15天种子区域完好。这些结果表明两种抗真菌药物联合接种也具有更好的保护作用。PGPR在苹果表面共培养可以提高苹果产量并减少真菌病害造成的损失。正如3.1节所证明的，SL44通过直接接触的方式杀死炭疽杆菌。同时，SL44和Wu15产生几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶来抑制真菌生长。枯草芽孢杆菌还可以产生抗真菌酶，抑制病原体真菌的生长，甚至通过降解细胞壁导致其死亡。因此，SL44 通过避免苹果表面炭疽杆菌的生长来保护苹果免于腐烂。

PGPR 附着在真菌病原体菌丝体上

扫描电镜分析：C. gloeosporioides SEM图像如图 3所示。处理后病原菌的菌丝结构塌陷，菌丝表面附着大量细菌，严重阻碍病原菌的生长。与 SL44（图 3B）。两次PGPR处理后，可观察到大量细菌附着在菌丝表面。与单独培养 Wu15 相比，两种 PGPR 菌株的共存显着增强了细菌细胞粘附，这归因于它们相互作用过程中产生的 EPS 增加了粘附能力 。使用或不使用生物防治剂的茄病菌的SEM图像如图S3所示，其表现出与胶孢炭疽病相似的现象。SL44 产生的 EPS 促进细菌在病原真菌菌丝体表面定植。定植细菌阻碍了真菌从周围环境中吸收营养，并显着阻碍了真菌病原体的生长。Wu15和SL44导致菌丝结构崩溃和随后的破碎。这一结果表明Wu15和SL44联合接种将在预防疾病方面发挥重要作用。

能源管理分析

为了进一步确定 PGPR 和真菌相互作用过程中 EPS 的变化，对 EEM 光谱进行了分析（图 4）。两种致病真菌仅含有海洋腐殖酸（Ex/Em 波长为 300–330/380–420 nm）。仅接种病原真菌就会导致海洋腐植酸的大量产生。海洋腐殖酸很容易与环境中的铁等微量元素形成腐殖酸-铁络合物，这可能对植物生长有害。相比之下，腐殖酸 (Em) 在与 PGPR 共培养后表现出红移，特别是对于 SL44 处理。土壤中产生的相关腐殖酸（Ex/Em波长为330-380/420-480 nm）有利于植物吸收和利用。所有 PGPR 处理均表现出强烈的瑞利散射（Ex = Em 波长为 300-500 nm），这是由 EPS 中的大颗粒引起的。SL44和Wu15的共培养进一步提高了EPS的产量，EPS是生物膜复合物的主要组成部分，并作为其主要成分促进其附着于菌丝表面。

PGPR 的进化抗真菌特性

在单独培养以及与病原真菌共培养期间评估了PGPR的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性（图5A，B）。几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶促进病原真菌细胞壁的降解，从而对多种病原真菌表现出显着的预防和治疗作用。所有病原真菌处理中几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的酶活性均显着增强。SL44酶活性提高8.12%与 Rs 共培养时为 12.08 %。Wu15与Rs共培养时酶活性提高了32.07%~59.94%。当混合菌与Rs共培养时，其酶活性也高于单个菌。在 PGPR 和 Cg 共培养过程中观察到类似的结果（图 5A，B 右）。由此可见，当PGPR与病原真菌共培养时，几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的酶活性增强，这也表明PGPR面对病原菌时的抗性反应有效增强。这些结果解释了两种 PGPR 的组合在疾病预防方面具有协同作用。这也是苹果表面抑制病原体生长的原因。

与原始菌株相比，与真菌病原体共培养30天后，Wu15和SL44表现出增强的生长能力（图5C）和抗真菌活性（图5D）。当祖先菌株与炭疽病菌共培养 24 h 时，OD600 = 2.20 (SL44) 和 2.03 (Wu15)；当与立枯病菌共培养时，OD600 = 0.55 (SL44) 和 1.92 (Wu15) 24小时。Gen3源自第三轮共同进化后的平板，与胶孢梭菌共培养24小时。它表现出很高的活菌数，OD600值达到2.87（SL44）和2.99（Wu15）。与立枯病菌共培养24 h时，OD600值分别达到2.85（SL44）和3.00（Wu15）。因此，当培养基中含有真菌病原体时，PGPR 的生长受到积极影响，表明通过共培养对细菌进化有促进作用。在 SL44-Wu15 处理中，PGPR 表现出与个体培养中观察到的相似的进化效应。此外，SL44有效抑制了胶孢梭菌的生长，导致共培养后平均病原体半径从14.9毫米减少到12.8-13.5毫米。Wu15有效抑制了立枯丝核菌的生长，导致平均病原体半径从23.3毫米减少到16.2-18.8毫米（图5D）。这一结果表明，在共培养后的平板对抗实验中，PGPR表现出增强的抑制真菌病原体的能力，导致7天后致病真菌菌落半径显着减小。此外，这两种 PGPR 菌株在调节生物胁迫耐受性、促进营养获取和赋予抗病性方面表现出巨大潜力。当两种PGPR同时暴露于同一病原菌时，它们的协同真菌抑制能力同时增强。此外，PGPR的抗病性通过进化过程得到增强。

PGPR 对土壤真菌群落结构及功能的影响

图7A、B 显示门和属水平的土壤真菌。排名前三位的门是子囊菌门、纤毛菌门和毛霉菌门。在仅含有病原体Cg或Rs的处理中，毛霉菌的比例为3.12%和4.65%，而CK的比例为3.41%。然而，接种PGPR后，该比例显着下降至1.24%~2.82%。子囊菌门是土壤中普遍存在的真菌门，C. gloeosporioides 就属于该门。单独接触病原真菌时，子囊菌门占14.4%和27.5%，但引入PGPR后，其比例降低至5.7%~11.7%。在子囊菌门毛壳菌中，Rs处理的比例高达16.22%，但接种PGPR后比例下降至1.10%~4.46%。真菌门的R. solani 与C. gloeosporioides（属于子囊菌门）相比，对毛壳菌表现出更大的增加效果。一种可能的解释是，立枯丝核菌破坏了自然土壤生态，从而为毛壳菌的生存创造了有利的环境。毛壳菌（一种常见于土壤中的嗜热真菌）的存在与 16 s rRNA 测试测定的嗜热细菌含量增加一致。Colpoda 是动物常见的致病属，属于纤毛虫门。当接种胶孢炭疽菌时，土壤中的Colpoda含量从1.50%增加到8.82%，但PGPR的存在将其降低到0.52%–2.58%。上述研究结果表明，植物病原体引起的土壤中常规微生物群落的下降导致了土壤生态的退化。结果，我们观察到真菌病原体的直接增加，包括植物病原体、动物病原体和嗜热真菌。

图7C,D 表示土壤真菌群落的营养模式和行会。接种立枯丝核菌后，土壤中腐生菌的比例从11.11%显着增加到33.15%。相反，当接种PGPR时，该比例下降至5.52％至9.50％之间，与木材分解功能表现出很强的相关性。CK 中木材腐养型真菌的比例为 2.91%。土传疾病，例如立枯病菌和炭疽病菌，通常通过有机物（包括落叶）传播。接种两种病原真菌导致木材腐生菌比例增加，达到16.22%（Rs）和3.10%（Cg）。接种PGPR后，木材腐生菌比例下降至1.10%~4.46%（Rs）和1.00%~1.11%（Cg）。结果清楚地表明PGPR在减轻土传病害方面发挥了积极有效的作用。

结论

本文对使用细菌 SL44 和 Wu15 治疗真菌疾病进行了全面的研究。SL44 在防治炭疽病方面表现出优异的功效，而 Wu15 在防治立枯病菌方面表现出优异的功效。两种生防菌联合接种时表现出很强的协同效应，有效抑制了两种病害的发生。此外，SL44产生的生物膜显着增强细菌对病原菌丝体的粘附，并有效抑制接触菌丝体的生长。此外，PGPR的应用有效促进了土壤中本土微生物群落的生长，并通过增加抑制疾病的化合物（几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶）的产生对病原真菌的增殖产生抑制作用。PGPR介导的根际微生物重排促进了土壤常规菌群的生长，抑制了土壤中病原真菌的比例，减少了真菌病害的发生。值得注意的是，混合处理在促进可持续农业发展和减少化学农药使用方面表现出卓越的效果。