以下文章来源于根际互作生物学研究室：
DOI:10.1186/s40168-024-01884-z
甲虫诱导的植物防御反应对抗P. versicolora（柳蓝叶甲虫）
为了验证植物在反复遭受叶甲虫侵害时是否采取防御措施，我们对中国武汉两个田间试验点的受昆虫损伤的病柳（SL）、健康柳（HL-HW）以及病柳（HL-SW）的健康叶片进行了取样，并用这些叶片喂养了Plagiodera versicolora的幼虫（SI附录，图S1）。我们发现，与HL-HW或HL-SW相比，P. versicolora幼虫对SL的损害较小，这一结果是基于幼虫消耗的面积（图1A和B）。此外，与健康叶片（HL）相比，从第二天起，以SL喂养的P. versicolora幼虫生长显著减缓（图1E），蛹化（图1C）和羽化率（图1D）也显著延迟。这些结果表明，甲虫的损伤能够激活植物对进一步害虫侵害的防御机制。
植物相关微生物群在植物防御P. versicolora中的作用
为了评估植物相关微生物群在受甲虫损害的柳树对P. versicolora的抗性中的贡献，我们从病态柳树（SL）和健康柳树（HL）的叶子中组装了两个合成微生物群落（SynCom-SL和SynCom-HL），并将它们引入到经过体外消毒的无菌病态或健康柳树叶片上（图2和图S3）。与重新引入SynCom-HL的无菌健康或病态叶片相比，重新引入SynCom-SL显著减少了对柳树叶片的损害（图2A和B），并且显著延迟了P. versicolora的蛹化（图2C）、羽化率（图2D）和幼虫体重（图2E）。这些结果表明，来自受甲虫损害的柳树的植物相关微生物群有助于提高其对P. versicolora的抗性。
方法（在不筛菌的情况下，如何验证健康和虫害叶片菌群的作用）：为了生成合成微生物群落（SynCom），从样本点采集了病叶（SL）和健康叶（HL）（每个个体植物采样6片叶子），用75%乙醇表面消毒1分钟，并用无菌水冲洗三次。叶子在无菌水中研磨，细菌悬浮液稀释至10^-2，并在22°C下在R2A平板上培养4天[22]。随机挑选了来自SL和HL的约80个菌落分别构成SynCom-SL或SynCom-HL。SynCom-SL或SynCom-HL被制备好，最终OD600调整至0.06（约2×10^7 CFU/mL），并将10微升的SynCom-SL或SynCom-HL悬浮液涂抹到每1平方厘米的柳树叶上。
假单胞菌属在受甲虫损害的柳树叶际中富集
接下来，我们通过深度测序扩增的细菌16S rRNA序列，研究了SL和HL叶际中细菌群落的组成。基于Bray–Curtis差异的非度量多维尺度（NMDS）分析表明，来自沙湖和南湖的SL和HL样本中的细菌群落存在显著差异（图3A和4A，B，ANOSIM，P < 0.01）。我们根据Shannon指数和Simpson指数估算了alpha多样性，并揭示了来自沙湖SL和HL叶际细菌的α-多样性指数之间存在显著差异（图3B，C，P < 0.01）。
效应大小的线性判别分析（LefSe）显示，假单胞菌属在SL叶际中的丰度显著高于HL（图5A和B）。同样，我们从SL和HL中分离出假单胞菌；的确，SL样本中存在的假单胞菌种比HL样本中更多（图5C）。这些结果表明，假单胞菌属在受甲虫损害的柳树叶际中富集。
假单胞菌在受甲虫损害的柳树根和根际土壤样本中的富集
最近几项研究表明，地上部病原体的感染也会改变根际微生物群落。因此，我们通过16S rRNA扩增子测序，测试了甲虫对叶片的损害是否也影响了根和根际土壤样本中的细菌群落。基于Bray–Curtis差异的NMDS显示，来自南湖和沙湖的受甲虫损害的病根（SR）和健康根（HR）的细菌群落存在显著差异（图3A和4C，D，ANOSIM，P < 0.01）。来自受甲虫损害的病柳（SS）和健康柳（HS）的细菌群落在南湖和沙湖的样本中也存在显著差异（图3A和4E，F，ANOSIM，P < 0.05）。SR的细菌群落与HR的alpha多样性在Shannon多样性指数方面没有显著差异（图3B，C，P > 0.05）。我们观察到SS和HS根际土壤细菌的α-多样性指数之间没有显著差异（图3B，C，P > 0.05）。
LefSe显示，与HR样本相比，SR样本中假单胞菌属的丰度显著更高（图6A和B）。同样，SS样本中假单胞菌的丰度显著高于HS样本（图6C和D）。
接下来，我们从受甲虫损害和健康柳树的根和根际土壤样本中分离了假单胞菌。我们确定，从SR或SS样本中分离出的假单胞菌的丰度显著高于从HR或HS样本中分离出的丰度（图6E和F）。这些结果表明，假单胞菌属在受甲虫损害的柳树的根和根际土壤中也得到了富集，与上述叶际的结果相似。
我们从受甲虫损害的柳树的叶际、根部和根际土壤样本中分离并鉴定了49株假单胞菌菌株。通过对这些菌株的16S rRNA基因序列进行系统发育分析，我们确定它们代表基于16S rRNA基因序列的不同系统发育群组。重要的是，我们特别在从SL叶片样本中收集的样本上检测到了九株P. psychrotolerans（Pp）菌株（图7）。这些结果表明，假单胞菌属在受甲虫损害的柳树中富集，并且显示出对甲虫的杀虫活性。
为了测试分离出的 P. psychrotolerans 菌株是否具有杀虫活性，我们让 P. versicolora 幼虫食用了涂抹了这些菌株细胞悬浮液的健康柳树叶子，并记录了幼虫的存活率。作为阳性对照，我们使用了从 SS土壤 中分离出的 P. chlororaphis PcS1-2 菌株和从 SR根 中分离出的 PcR3-3 菌株。我们发现，在测试的九株 P. psychrotolerans 菌株中，有七株导致了 P. versicolora 幼虫的死亡率更高（图 8A）。此外，与作为对照的磷酸盐缓冲液（PBS）涂抹的柳树叶子相比，涂抹了这些 P. psychrotolerans 菌株的柳树叶子遭受 P. versicolora 幼虫的损害较小（图 8B 和 C）。这些结果表明，富集在受甲虫损害的柳树中的一些假单胞菌菌株对 P. versicolora 表现出杀虫活性。
为了鉴定与观察到的杀虫活性相关的潜在基因，我们对从受甲虫损害的柳树中分离出的 P. psychrotolerans 菌株 PSE37 或 PSE38 进行了基因组测序和组装。我们的分析揭示了在 PSE37 或 PSE38 菌株的基因组中缺少编码杀虫蛋白的基因，例如 Fit 毒素、IPD072、几丁质酶 C 和磷脂酶 C，这些基因通常在 P. protegens 和 P. chlororaphis 中存在（补充材料附录，表 S9）
为了测量在受甲虫损害的柳树中富集的假单胞菌菌株对整株植物抵抗P. versicolora的贡献，我们重建了一个由从SL叶片中分离出的七株P. psychrotolerans（Pp）菌株组成的合成微生物群落（SynCom-mix7）。将SynCom-mix7或假单胞菌菌株PSE37/38重新接种到健康柳树上，与用磷酸盐缓冲液（PBS）作为对照的处理相比，P. versicolora幼虫的死亡率达到了56%（图9）。这些结果表明，富集在受甲虫损害的柳树中的一些假单胞菌菌株对P. versicolora表现出杀虫活性。
本研究创新点在于：
1.做的是叶际微生物，分离了多个叶片假单胞菌并单一验证了每个菌的作用，随后把效果最大的菌组合成菌群，再次验证效果。其次这里抗虫的机制没有从植物生理指标（如激素）出发，而是假单胞菌对害虫的直接杀灭作用,这是通过涂抹到叶片上获得表型以及对分离的假单胞菌进行全基因组分析，聚焦于一些毒性基因。
2.在受到昆虫食草性损害时，植物可以通过富集具有杀虫活性的假单胞菌来增强其叶际，以提高对昆虫害虫进一步损害的防御，为植物防御害虫提供了新的见解
没有涉及（待补充）：
这个研究还是在地上部昆虫-地上部叶际微生物之间的互作，没有说明叶际微生物变化的原因以及地下部微生物在这其中的作用。
根际互作生物学研究室 简介
根际互作生物学研究室是沈其荣院士土壤微生物与有机肥团队下的一个关注于根际互作的研究小组。本小组由袁军教授带领，主要关注：1.植物和微生物互作在抗病过程中的作用；2 环境微生物大数据整合研究；3 环境代谢组及其与微生物过程研究体系开发和应用。团队在过去三年中在 Nature Communications，ISME J，Microbiome，SCLS，New Phytologist，iMeta，Fundamental Research， PCE，SBB，JAFC（封面），Horticulture Research，SEL（封面），BMC plant biology等期刊上发表了多篇文章。欢迎关注 微生信生物 公众号对本研究小组进行了解。
撰写：杨盛蝶
修改：文涛
排版：刘泽鹏
审核：袁军 团队工作及其成果 （点击查看）
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小组成员文涛：taowen@njau.edu.cn等
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