种间相互作用促进关键种在多物种生物膜中的作用从而促进植物生长

概要总结

在植物根部定植的微生物在复杂的、空间结构的多物种生物膜群落中共存。然而，关于微生物相互作用和植物根部生物膜群落的潜在空间组织知之甚少。本研究以拟南芥根系为研究对象，建立了嗜根窄养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、氧化微杆菌和逆转录黄单胞菌(SPMX)四种生物膜模型，研究了多种生物膜对植物生长的影响及根系的群落空间动态。SPMX共培养显著促进了根系发育和植株生物量。共培养SPMX增加了根定植，形成了多种生物膜，结构上不同于单培养形成的生物膜。结合16S rRNA基因扩增子测序和共聚焦激光扫描显微镜荧光原位杂交，发现四种生物膜的组成和空间组织随着时间的推移发生了显著变化。溶淀粉菌对植物根的定殖能力较差，但在四种生物膜中，其种群数量和根定殖能力都得到了极大的增强。若将溶淀粉假单胞菌排除在群落外，三种植物的整体生物膜产量和根定植量均下降，导致植物生长促进作用丧失。结合空间分析，确定溶淀粉假单胞菌为关键种。研究结果表明，在复杂群落中，弱根定殖生物可能受益于相互作用，从而成为影响群落空间组织和功能的重要基石物种。本研究扩展了对植物根系多物种生物膜群落种间相互作用的空间组织的认识，有利于利用微生物共生促进植物生长。

四种群落促进了拟南芥根系发育

为了研究四种(SPMX)群落对植物生长的影响，将拟南芥幼苗在MS培养基上培养7天，接种SPMX共培养物，孵育5、10和15天(D5、D10和D15)。从D5到D15，与未接种SPMX的对照植株相比，SPMX共培养显著促进了植株的生长和根系发育，包括主根和侧根(图1A)。

在D5时，接种SPMX的植株主根长和地上部鲜重均较未接种SPMX的对照略有增加。然而，接种SPMX(对照)和未接种SPMX(对照)的植株在D10和D15的主根伸长上存在显著差异(中位数:2.2 vs. 1.5 cm和2.8 vs. 2.1 cm;P = 0.016, P = 0.0079, Wilcoxon检验)(图1B)。同样，接种SPMX显著增加植株鲜重，达到3.9 mg(中位数)，与对照(中位数:2.7 mg)相比，在D10时增加了44.4% (P = 0.0054, Wilcoxon检验)。接种spmx的对照植株与未接种spmx的对照植株之间的这种显著差异在D15时更为明显。与对照植株相比，用SPMX孵育15天植株的茎鲜重平均增加了81.1%(中位数:6.7 vs 3.7 mg, P = 8.2e-05, Wilcoxon检验)(图1C)。结果表明，SPMX对植株生长和根系发育的促进作用至少持续15 d。

四种群落在根系上形成多种生物膜并随时间生长

为了进一步分析根上形成的SPMX多物种生物膜的组成和空间组织，采用FISH对SPMX生物膜群落中的4个不同物种进行了标记。Pa、Mo、Sr和Xr分别用Cy5(红色)、Cy3(黄色)、FAM(绿色)和Pacific blue(蓝色)标记(图3A和补充表1)。首先，我们通过SPMX共培养和4个单培养与所有4种FISH探针杂交，证实了4种设计探针的FISH特异性和高杂交效率(图3A和图S3)。

在根表面的微尺度上观察到具有代表性的四种(SPMX)生物膜的形成，表明四种FISH探针的成功应用(图S4)。利用SPMX在根面(根表面)共培养形成的多物种生物膜的空间结构FISH-CLSM在D5、D10和D15处(图3B和图S5)。所有四种细菌都从D5开始定植根，表明它们都在早期定植根，而在未经处理的对照根中没有检测到来自细菌的信号(图3B和图S5)。从D10到D15, SPMX多物种生物膜在根部生长明显，与D5相比，SPMX在根部形成了相对较厚的生物膜(图3B)。这些观察结果得到了qPCR定量的支持，对所有四种定植在整个根上的细胞总数进行了计数(图3C)。多物种生物膜细胞数从D5到D10略有增加，但无统计学差异(经校正P > 0.05, Kruskal-Wallis检验)(图3C)。但从D10到D15，细菌细胞数量显著增加(经校正P < 0.01, Kruskal-Wallis检验)，表明随着时间的推移，根上的多物种生物膜显著生长。特别是，与D5相比，在D10和D15时，Pa的根定殖增强(图3B)。通过qPCR在对照组中仅检测到少量的16S rRNA基因拷贝(每毫米约102个)(图3C)。

溶淀粉单胞菌影响四种生物膜群落的空间组织和功能

为了进一步研究四种生物膜群落的空间组织，基于FISH-CLSM获取的三维图像的像素量化和分析，研究了D5、D10和D15处拟南芥根系SPMX生物膜群落的空间动态(图5A)。首先量化了根上SPMX生物膜群落中各物种的绝对丰度(生物量)随时间的变化。根表面SPMX生物膜的总生物体积从D5 (~ 2.5 × 104 μm3)显著增加到D15 (~ 1.6 × 105 μm3)(图5B)。具体来说，很明显，在D15时，Pa在SPMX生物膜群落中显著增加并达到更高的丰度，而Mo和Sr随着时间的推移都保持较低的丰度(图5B)。在三个时间点获得的通过根部的四种生物膜的剖面显示了个体物种的不同空间组织，其中物种Sr经常位于生物膜的底部，靠近根部(图S6)。

从FISHCLSM中也观察到Sr在根侧的定植模式(图3B)， Sr通常位于生物膜和根表面之间的界面。虽然从D5到D15, Xr的绝对生物体积也有所增加，但在D15, Pa种群增长显著，成为优势种(Kruskal-Wallis检验，P = 0.004，经FDR调整)。Pa的相对丰度和绝对丰度的显著增加表明，Pa可能与其他三种生物膜成员中的一种或全部相互作用(图4B和5B;图S7)。

随着时间的推移，这种Pa的拔出显著影响了根表面SMX生物膜的厚度和组成，与SPMX群落相比，导致生物体积和根定植显著减少(图5A)。随着时间的推移，SMX群落的组成和总生物量都没有发生显著变化(Kruskal-Wallis检验，P = 0.056)，表明SMX不生长在根上，这与SPMX群落有明显不同(图5B)。整根定植的细菌总数的qPCR定量也支持了这一点，其中定植细胞的数量也没有随着时间的推移而增加(图5C)。此外，SMX群落(不包括Pa)随着时间的推移失去了对根系发育和生物量生产的促进作用(图5D)，因为对照和SMX处理的植物之间没有显著差异(图5E和F)。这些结果表明，Pa是影响植物根系四种生物膜群落组成和功能的关键物种。

Pa在空间上组织与其他物种的相互作用

为了进一步研究Pa如何在空间上组织与其他物种相互作用，分析了Pa与生物膜中其他三种物种的空间组织关系。首先，进行了Pa与其他物种的三维共定位分析，量化了Mo、Sr和Xr在Pa一定距离上的生物体积丰度。Pa与生物膜群落中其他三个物种的共定位分析表明，D5处的其他三个物种在Pa附近的丰度较低，并且似乎分布均匀，尽管在5 μm距离内Mo比Sr和Xr更接近Pa，而在从D10到D15的~ 10 μm空间距离内，所有三个物种(Mo, Sr和Xr)都与Pa密切相关。在距离Pa约5 μm的空间距离内，这三种物种的丰度都在Pa附近达到最大值，而当距离Pa大于10 μm时，这些物种的丰度就会下降。从D10到D15, Xr在Pa附近的定殖丰度最高。此外，从D5到D15, Pa附近三个物种的丰度都逐渐增加，但在D15, Sr的丰度高于Mo。这些结果揭示了一种空间相互作用模式，其中其他三种生物膜成员在约10 μm微尺度上富集在解淀粉假单胞菌周围。

四种群落中每个物种在根系表面的空间定植情况

接下来通过量化根系上的细胞聚集量，分析四种群落中每个物种在根系表面的空间定植情况。在D5时，根表面的Pa团聚体较小且数量较少，而在D10时，Pa团聚体的数量增加了5倍(平均团聚体数为35比7)。与D5相比，这些细胞聚集体的大小在D10时保持不变。而在D15时，Pa团聚体的数量不仅增加了，而且团聚体也变大了。这些Pa聚集体在D15时比在D5时大10倍(聚集体大小，103 μm3 vs 102 μm3)，也显示在3d刺激图像中，不同的细胞聚集体形成根表面的Pa。在其他物种(Mo, Sr和Xr)中没有观察到这样的定植模式，尽管Sr和Xr的细胞聚集大小在D15时确实增加了(图S8)。这表明，Pa种群的增加是通过根表面的分散定植，然后是聚集生长，导致Pa的生物体积和相对丰度增加。

综上所述，这些结果进一步表明，Pa是影响植物根系生物膜群落空间组织和功能的关键物种。根相关细菌之间相互作用，在根表面形成复杂的多物种生物膜，对植物的健康和生产力有着深远的影响。本研究发现四种细菌群落(嗜根寡养单胞菌、逆转录黄单胞菌、氧化微杆菌和解淀粉芽孢杆菌SPMX)在拟南芥根上共培养时具有生物膜协同作用，具有植物生长促进作用。

结论

由于根表面形成的多物种生物膜的空间组织，四种细菌群落对植物生长的长期有益影响。通过对植物根系上多物种生物膜群落的空间组织和动态分析，结合“拔出”策略，揭示了一种促进关键物种的种间相互作用模式。此外，研究证明了一个细菌物种如何在其他群落成员存在的情况下建立和生长，并最终成为根上的关键物种。这与细菌作为生物肥料的应用高度相关，因为促进和保护植物的菌株本身可能不是强大的定殖者，但当与其他菌株共接种时，能够在群落中建立互惠关系。因此，该研究提供了对空间组织的理解，揭示了种间相互作用，塑造了植物根系的群落建立和功能，这可能有助于未来在复杂生态环境中操纵生物肥料的性能。