Plants interfere with non-self recognition of a phytopathogenic fungus via proline accumulation to facilitate mycovirus transmission

摘要

非自我识别是生命的一个基本方面，是减轻真菌种群内分子寄生虫增殖的关键机制。然而，调查植物对真菌非自我识别机制的潜在干扰的研究是有限的。在这里，我们证明与体外相比，植物中营养不相容的核盘菌菌株之间的水平真菌病毒传播效率显着增加。这种效率的提高与核盘菌感染后植物中脯氨酸浓度的升高有关。脯氨酸水平的激增通过抑制细胞死亡来减弱真菌之间的非自我识别反应，从而促进真菌病毒的传播。此外，我们的田间实验表明，将含有低毒力相关真菌病毒（HAV）的低毒力核盘菌菌株与外源脯氨酸结合使用，可以为油菜植物提供实质性保护，使其免受剧毒核盘菌的侵害。这一史无前例的发现阐明了一种新的途径，植物可以通过这种途径利用真菌非自我识别的减弱和促进 HAV 的传播来抵抗核盘菌感染。这些有希望的见解为探索开发创新生物控制策略提供了一条途径，旨在通过增强 HAV 水平传播的功效来减轻植物中的真菌病害。

植物中S.sclerotiorum菌株之间的真菌病毒传播增强

核盘菌菌株 Ep-1PN 与核盘菌衰弱相关 RNA 病毒 (SsDRV) 和核盘菌 RNA 病毒 L (SsRV-L) 共同感染，表现出几种与低毒力相关的表型特征，包括菌落形态异常、生长速度降低，并降低对油菜（Brassica napus）植物的毒力。菌株 Ep-1PNA367 是一种无毒力的 HAV 菌株，通过单一子囊孢子分离从 HAV 感染的 Ep-1PN 中获得，因此与 Ep-1PN 营养相容。Ep-1PN 和 Ep-1PNA367 在马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 上共培养导致真菌病毒从 Ep-1PN（供体菌株）到 Ep-1PNA367（受体菌株）不受限制地水平传播，将 Ep-1PNA367 转化为低毒力菌株的异常菌落形态和生长速度下降。相反，真菌病毒很少通过 PDA 从 Ep-1PN 传播到不相容的菌株 1980m、SG9 和 SCH941A1，如受体菌株中缺乏与低毒力相关的特征所示。在油菜植物上，与四种强毒株相比，HAV 感染株 Ep-1PN造成的病斑明显更小。值得注意的是，与单独的强毒株相比，所有四种强毒株与 Ep-1PN 的共同接种导致的病变明显更小。这些观察结果表明，在植物中，尽管有 VIC，真菌病毒仍从 Ep-1PN 水平传播到强毒株，从而赋予低毒力。

为了检验这一假设，我们通过在含有潮霉素的 PDA 上进行三轮传代培养，从植物病斑中重新分离出带有潮霉素抗性标记的不相容菌株 1980m。随后的逆转录和聚合酶链式反应 (RT-PCR) 证实了 1980m 真菌病毒 SsDRV 和 SsRVL 的存在，植物中的传播频率明显高于 PDA 上的传播频率（SsDRV 为 79%，SsRVL 为 25%）（25%）。对于 SsDRV 为 6%，对于 SsRVL 为 6%）。这种增加的传播率只有在对新鲜叶子进行实验时才能观察到，而不是在之前储存在-80°C的叶子上，这表明叶子必须具有代谢活性才能影响传播率。因此，我们得出结论，油菜植物可以增强真菌病毒在不相容菌株之间的水平传播。

植物中真菌 VIC 相关基因下调

为了揭示真菌病毒在植物中传播能力增强的潜在机制，将菌株 1980m 与感染 HAV 的 Ep-1PN 菌株和不含 HAV 的 Ep-1PNA367 菌株分别在 PDA 和植物上共培养。随后，在核盘菌基因组中鉴定了与自身/非自身识别反应和G蛋白信号通路相关的基因，并比较了它们的体外和植物表达水平。总共鉴定了 40 个编码具有保守 HET 结构域的蛋白质的基因，其中大多数在植物中与体外相比下调。此外，还鉴定了编码 G 蛋白的 6 个基因，包括 3 个 Gα（sscle_11g084840、sscle_05g042960 和 sscle_16g109000）、2 个 Gβ（sscle_07g056270 和 sscle_03g023580）和 1 个 Gγ（sscle_06g053750）。与体外相比，除 Gβ2 外，所有其他蛋白在植物中均下调。值得注意的是，EP-1PN 中 HAV 的存在似乎对上述基因的表达水平没有显着影响。因此，VIC反应的减弱归因于植物-真菌相互作用，而不是真菌病毒感染。我们利用公开的转录组数据进一步比较了其他植物病原真菌在体外生长和植物感染期间编码G蛋白的基因的表达水平。我们的分析表明，与体外表达相比，这些基因中的大多数在植物中下调，表明它们在植物-真菌相互作用期间的抑制可能是普遍的。

真菌感染诱导的植物脯氨酸积累增强了真菌病毒的传播

脯氨酸水平部分受到吡咯啉-5-羧酸酯 (P5C) 水平的影响，其前体分子由吡咯啉-5-羧酸酯合酶 (P5CS) 48,49 酶促合成。油菜被感染 HAV 的低毒株 Ep-1PN 和无 HAV 的强毒株 Ep-1PNA367 感染后，脯氨酸水平分别增加了 4 倍和 10 倍。脯氨酸水平的这种增加似乎是对真菌感染的反应，因此与同基因低毒力菌株相比，在诱导更严重感染的强毒菌株存在时更加明显。在核盘菌感染期间，在拟南芥 Col-0 植物中也观察到类似的脯氨酸增加。植物通常具有两个p5cs基因，并且在感染Ep-1PNA367的油菜和拟南芥Col-0植物中，p5cs2而非p5cs1表达水平上调，表明脯氨酸的增加至少部分源于上调负责合成其前体分子的酶。

菌丝融合过程中的非自我识别通常与活性氧（ROS）的积累和程序性细胞死亡（PCD）的启动同时发生 1,5 。众所周知，脯氨酸可作为 ROS 清除剂并抑制类细胞凋亡的 PCD 。因此，我们假设在植物中观察到的不相容真菌菌株之间的真菌病毒传播增强是由植物产生的脯氨酸促进的。为了检验这一假设，使用拟南芥 Col-0 突变体与野生型进行表型比较，该突变体在 p5cs2 中插入 T-DNA，导致核盘菌感染期间脯氨酸产量受损。用 Ep-1PN 和 1980m 共同接种野生型和 p5cs2 突变体植物显示，与野生型相比，p5cs2 突变体中的病斑明显更大，而外源脯氨酸的施用减轻了 p5cs2 突变体植物增加的敏感性。随后，从野生型和p5cs2突变体植物的病斑中重新分离出1980m，并证实了HAV感染，与野生型相比，p5cs2突变体中的传播频率显着较低。重要的是，只有在脯氨酸和HAV感染菌株同时存在的情况下才观察到疾病严重程度的降低，这支持了脯氨酸增强真菌病毒传播而不是诱导植物对病原真菌的抗性的观点。

外源提供的脯氨酸增强了真菌病毒的传播

为了提供脯氨酸增强真菌病毒传播的进一步证据，并探索易于处理的体外系统中的潜在机制，我们在补充有浓度范围为3.2 μM至320 mM脯氨酸的PDA上建立了真菌培养物，其中Ep-1PN和1980m表现出强劲的生长。在这个体外系统中，从 Ep-1PN 到 1980m，在 3.2 mM 脯氨酸处观察到 SsDRV 和 SsRVL 的最高传输频率，该浓度随后用于所有进一步的实验并指定为 PDA + P。在接触区域内的边缘处注意到1980m的菌丝分支。总之，这些结果表明脯氨酸，无论是由植物产生还是外源应用，都可以直接促进不相容的核盘菌菌株之间的真菌病毒传播。

为了评估这种现象是否在核盘菌中普遍存在，我们测量了先前报道的六种低毒力菌株（即 SZ-150、SX276、Ep-1PN、WF-1、AH98 和 SCH733）中 HAV 的水平传播率。，对于不相容的菌株SG9和1980m。将每个感染 HAV 的供体菌株与每个无病毒的受体菌株在 PDA 和 PDA + P 上共培养。在所有组合中，脯氨酸的添加导致 HAV 从供体到受体的传播增加，无论真菌病毒是否包含 dsRNA或ssRNA基因组。这一发现表明脯氨酸介导的真菌病毒传播促进在核盘菌中是一种广谱现象。

脯氨酸促进菌丝融合，抑制 VIC 相关基因的表达，并减少真菌中 ROS 的积累

为了研究脯氨酸介导的真菌水平传播增强的细胞、生化和分子机制，我们首先检查了脯氨酸对不相容菌株之间菌丝融合的影响，特别是与 VIC 反应相关的 PCD 的诱导 1,9,53 。经过伊文思蓝测定和扫描电子显微镜 (SEM) 可视化后，在 PDA 上的 1980m 和不相容菌株 Ep-1PNA367 或 SCH733 之间的界面处清楚地观察到典型的坏死区，但在 PDA + P 上显着减弱。重要的是，该坏死区在相容菌株 Ep-1PN 和 Ep-1PNA367 之间根本不明显。这一观察结果，加上理论上，PDA 41 上两个相容菌株之间的真菌病毒传播效率应为 100%，因此高于 PDA + P 上两个不相容菌株的真菌病毒传播效率。脯氨酸减弱但并未完全消除不相容菌株之间的 PCD 反应。通过透射电子显微镜（TEM）检查1980m与其不相容菌株之间的界面，发现PDA上细胞器降解和广泛的细胞质空泡形成，而PDA + P上细胞质空泡形成减少，菌丝融合增强。用于检测死亡细胞的碘化丙啶（PI）染色进一步证实了 1980G 和 Ep-1PNA367G 在 PDA 上共培养期间的细胞死亡，而在 PDA + P 上没有明显的 PI 染色，表明不存在细胞死亡。共焦荧光显微镜可以观察到 1980m 和 Ep-1PNA367G 之间的菌丝融合，在 PDA + P 上很明显，但在 PDA 上则不然。

随后，我们对 PDA、PDA + P 和植物中两种不相容的核盘菌菌株进行了转录组分析。与 PDA 相比，PDA + P 上总共有 1285 个差异表达基因（DEG；>2 倍水平），其中 1595 个和 690 个分别下调和上调。基因本体论（GO）“生物过程”和“细胞成分”术语被发现在上调基因中丰富，包括细胞壁组织或生物发生、液泡、细胞壁、膜和细胞外区域。相反，下调基因中丰富的GO“生物过程”术语包括运输（跨膜、脂质、离子等）、对环境因素（氧化应激、热、化学和DNA损伤刺激等）的反应，和细胞壁重塑。与植物中的观察结果一致，与PDA相比，编码HET和G蛋白的基因的表达水平在PDA+P上主要下调。然而，当共培养两种相容的核盘菌菌株时，PDA 和 PDA + P 之间这些基因的表达水平没有显着变化，这表明在这种情况下没有发生 PCD 反应，正如基于我们在微观层面上的观察。当不相容菌株在PDA上接触时，两个ROS相关基因的表达水平被诱导，但这种诱导在PDA + P上受到抑制。此外，硝基蓝四唑 (NBT) 染色显示，在裂解后暴露于 Ep-1PNA367 上清液的 1980m 中，脯氨酸抑制 ROS 积累。

脯氨酸下调真菌 VIC 相关基因阻碍真菌病毒传播

为了检查在体外和/或植物中表达被脯氨酸下调的任何基因是否在水平真菌病毒传播中发挥作用，我们在菌株 1980 的遗传背景中为其中的一个子集生成了缺失突变体。这种缺失突变体分析包括基因Ssvic1至Ssvic6、Ssvib1和Sscwr1至Sscwr3，编码含有HET/NT80或LMPO保守结构域的蛋白质。Ssvic2 缺失导致生长减少，而 Ssvib1 缺失影响菌核发育，包括其形态和数量。其余缺失表现出与其亲本菌株相似的菌落形态和生长速率。随后，Ep-1PN（供体）与 1980m 或单个缺失突变体（受体）在 PDA 上共培养。大多数作为受体菌株的缺失突变体边缘的菌丝表现出过度分枝和生长减少，特别是在 ΔSsvic3 的情况下。然后将受体菌株在含有新霉素的PDA上传代培养三代以完全消除供体，并使用RT-PCR评估真菌病毒的传播率。与其亲本菌株相比，ΔSsvic1、ΔSsvic3、ΔSsvic4、ΔSsvic6、ΔSscwr1 和 ΔSscwr2 的传播率显着增加。值得注意的是，大约 75% 的测试的 ΔSsvic3 亚分离株表现出与低毒力相关的表型特征，与 SsDRV 传播率一致。

外源脯氨酸提高甲型肝炎病毒生防效率并提高油菜产量

为了确定利用 HAV 与外源脯氨酸结合加强控制核盘菌病的实验室研究结果的适用性，我们在 2021 年至 2022 年对油菜进行了为期 2 年多的田间试验。2021 年，发病率下降了 41.9%。与未处理的对照组相比，Ep-1PN 和脯氨酸联合治疗后，发病率降低了 26.9%，产量增加了 11.2%，而单独使用 Ep-1PN 治疗后，发病率降低了 26.9%，产量增加了 4.8%。2022 年进行的现场实验也观察到了类似的结果。