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Environmental Research：一种基于数字幻灯片扫描仪和图像处理的高精度半自动化球形微塑料定量方法
引入：
研究对象多为球形MPs，作为常见的形状。因为球形MPs更容易获得标准化的实验材料，便于不同研究结果的比较。此外，在建模实践中，球体通常被假设为MPs的形状，这使得球形MPs更适合开展基础研究。因此，发展可靠的球形MPs定量方法在MPs的实验室研究中十分重要。
因此，该文的主要工作包括:(1)利用Olympus VS120数字滑动扫描仪对滤膜的摄影方式进行优化;(2)利用MPs-Counter软件提高图像处理的精度和效率;(3)调查污水对该方法的影响。基于这些目标，工作旨在探索和建立一种可靠的球形MPs定量方法。
实验过程：
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图1（VS120-MC的工作流程。(a)样品制备;(b)图像采集;(c)图像预处理;(d) MPs图像识别。）![]()
图2（弱圆消除算法(WEA)流程图。D为两个圆心之间的直线距离;ΔX表示两个圆心的水平坐标之差;R表示候选圆的半径。）各种饮料中含有不同形状(纤维和碎片)、大小(0.1至3毫米)和颜色(包括蓝色、红色、棕色、黑色和绿色)的微塑料，平均含量为28±5.29粒/升(见图2)。研究发现，聚酰胺(PA)和聚酯酰胺(PEA)是啤酒、冰茶和能量饮料等饮料中最常见的微塑料污染类型。塑料包装的饮料可能含有微塑料，因为塑料会逐渐渗入饮料中。然而，关于颗粒物(PM)对人类食用作物的危害的研究并不多。最近的研究发现，13 μm聚乙烯微塑料(PE-MPs)对人类重要食物来源的农作物有相当大的抑制作用。
实验结果讨论:
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图3 （VS120-MC的图像处理程序。(a) VS120采集的滤膜扫描图像;(b)全面积图像裁剪图像;(c)对二值图像进行边缘采集，(d)宽半径范围CHT， (e)弱圆消除算法，(f)变系数阈值后的裁剪图像结果。(d)和(e)中的箭头分别指出了假阳性圆和不规则杂质。）![]()
图4 (MPs- counter与Image-Pro Plus识别性能比较。(a)不同聚集度和图像分辨率下的识别误差热图;(b)聚集度与识别误差的线性关系;(c) (i)线性、(ii)三角形、(iii)矩形和(iv)五边形聚合MPs构型模型;(d)不同配置和重叠程度下的识别结果。）
如图3(a)所示，VS120无缝捕获了全区域图像，与3%重叠区域的图像拼接相比，减少了MPs信息的丢失(Richter et al, 2023)。然后制备无损切割图像(图3(b))进行识别。然后在识别边缘的基础上进行CHT(图3(c))。初步识别出规定半径范围内的球形MPs [R1, R2]。很明显，仅依靠CHT会产生假阳性圆，如图4(d)所示。此外，假阳性圆多为较小聚集圆周围较大的圆。很明显，这种误差的产生是由于不准确的半径范围。由于荧光MPs在不同图像中的粒径范围波动较大，为了便于批量处理，通常设置较大的半径范围。因此，有必要在CHT之后应用WEA算法，以保证识别的准确性。对比图3(d)和(e)可以看出，在实施WEA算法后，过多的重叠或嵌套的圆已经消失。但是，仍然出现了一些假阳性的圆圈，如图3(e)中箭头所示的圆圈。为了最大限度地减少不规则杂质对MPs假阳性的影响，主要是由于对弧形边缘的荧光杂质的误判，采用VCT对识别圆的上、下、左、右、中5个点的灰度可变系数上限进行限制。最终识别结果如图3(f)所示。可以看出，避免了较大的假阳性圆和不规则荧光杂质的干扰，对MPs进行了清晰准确的鉴定如图4(a)所示，随着MPs聚合从0-0.5%增加到4.5-5.0%，分辨率从4000 × 4000增加到1000 × 1000, Image-Pro Plus的识别错误率从0.42%急剧增加到11.21%。此外，如图4(b)所示，Image-Pro Plus的识别误差与聚合MPs的含量之间存在很强的线性关系(Pearson’s r = 0.975)。相比之下，MPs-Counter的误差与聚合指标的相关性要弱得多。为了全面比较MPs- counter和Image-Pro Plus对聚合MPs的识别效果，利用MATLAB生成了不同配置的模拟MPs聚合(图4(c))。从图4(d)中可以看出，ImagePro Plus在分割线性MPs聚集体方面表现良好，但在处理三角形、矩形和五边形聚集体时，其性能急剧下降。相比之下，MPs- counter对不同配置的MPs聚合体表现出出色的分割效果。![]()
图5（MPs- counter和Image-Pro Plus对10 μm (a)和1 μm (b)球形MPs在超纯水中的定量性能比较。(c)和(d)分别是(a)和(b)中箭头所指的具体情况。）
如图5 (a)和(b)中的箭头所示，Image-Pro Plus偶尔会出现明显的计数错误。具体来说，在处理含有聚合度高(图5 (c))或荧光强度不均匀(图5 (d))的MPs图像时，MPs- counter的粒子分割能力和颜色梯度灵敏度远远超过了Image-Pro Plus。![]()
图6（Bland-Altman图比较了(a) 10 μm和(b) 1 μm球形MPs的真实图像的手动计数结果和MPs- counter计数结果。）
大多数数据点都在95%的一致性范围内，只有少数零星的点位于10 μm和1 μm的边界之外。这些结果表明，MPs- counter和人工计数具有良好的一致性，可以在超纯水中互换使用，即使是1 μm球形的MPs。![]()
图7（不同拍摄次数下不同拍摄方式的对比。(a)每张滤膜50张图片(b)每张滤膜200张图片。）在三种摄影模式中，分区扫描摄影与真值的相关性最高，Pearson’s r为0.97，说明与VS120-MC的相关性更强。然而，这种方法本质上是VS120-MC的简化版本，因为它依赖于普通显微镜所缺乏的扫描摄影。当采用随机摄影时，可以发现计数结果与真实值之间存在显著差异。在共捕获50幅图像后，分区随机模式和全膜随机模式的Pearson相关系数分别降至0.92和0.78。![]()
图8（MPs- counter在(a) 10 μm和(b) 1 μm球形MPs污染水中的性能。NFCW =纳滤浓缩废水，LW =湖水，P:预处理。）对于MPs- counter，纳滤浓缩废水和湖水预处理对10 μm球形MPs计数影响较小(R2分别从0.984增加到0.994和0.998)。相反，污染水对1 μm球形MPs产生明显的团聚现象。它严重干扰了成像过程中焦平面的选择。经消化后，获得的1 μm球形MPs图像符合MPs- counter的识别标准，计数精度可接受。![]()
图9（用(a)各自的最优参数和(b)同一组参数处理六组实景图像的小提琴图。UPW =超纯水，LW =湖水，NFCW =纳滤浓缩废水，P:预处理。）
使用相同的参数(在超纯水中优化为10 μm组)，MPs-Counter的计数与真实值相差不显著。此外，它们的数据分布与真实值非常接近。
该文建立了一种新的球形MPs定量方法VS120-MC。VS120- MC通过数字滑动扫描仪VS120实现了MPs滤膜的无缝扫描，通过半自动图像处理软件MPs- counter实现了球形MPs的高精度识别。全面积扫描摄影避免了局部采样的不确定性，减小了操作者之间的照片差异。为了实现大半径范围内的批处理，设计了一种新的算法，称为WEA算法。
此外，MPs-Counter还包括一个VCT参数，用于去除不规则杂质。为了具体展示MPs- counter的优异性能，采用不同干扰因素的模拟MPs图像，比较MPs- counter和Image-Pro Plus的识别能力。结果表明，MPs的聚集度、图像分辨率和重叠MPs的配置对MPs- counter的干扰均小于image - pro Plus。VS120-MC的最小尺寸限制为1 μm，这也是目前视觉显微镜的极限。目前的消化法可能并不一定适合在有机物浓度较高的污染水中提取小颗粒MPs，这可能需要更多和更强的过氧化氢。但与此同时，它需要小心防止MPs的退化。
文章回顾
=》Environmental Research：新冠疫情大流行的环境影响：在周围环境影响下口罩释放出的微塑料、有机污染物和微量金属
=》富铁水生环境中溶解有机物介导的微塑料光老化机制
