多载荷ADC：仍是一个很大挑战

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目前，所有临床使用的抗体药物偶联物(ADC)都是单一的有效载荷(Payload)。

临床上所采用组合疗法通过产生协同抗癌作用并减缓耐药细胞群的产生来改善治疗结果。为了复刻临床联合给药方案所产生的靶向治疗功效，ADC领域已转向开发新技术用于将多个独特的Payload以高同质性偶联到单个抗体分子上(图1)。

然而，由于构成抗体表面的反应性官能团过多，生成此类同质多药ADC (Homogeneous multi-payload ADC)的方法繁多复杂。

图1.多药ADC的概念与治疗定位

小分子不同作用机制，助力多载荷ADC

肿瘤包含多种细胞群的异质混合物，每种细胞群具有不同水平的治疗耐药性。在治疗选择压力下，由于先前存在的亚克隆群体的扩张或耐受治疗的细胞的进化，对治疗的抵抗力可能会增加。正是由于这个原因，几乎所有有效的小分子化疗都包含两种或多种具有不同作用机制(MoA)的互补药物进行共同递送。这种多有效负载方法不仅可以最大程度地减少耐药细胞群的发展，而且还可以提供叠加甚至协同的抗癌作用。

到目前为止，ADC领域的联合治疗研究还很有限，因此当前许多基于ADC的疗法都存在获得性耐药性，因此无法提供持久的治疗效果。因此，ADC联合疗法目前受到广泛关注。除ADC已与免疫检查点抑制剂、单克隆抗体、双特异性T细胞接合剂和分子靶向药物联合给药外，将抗体与多种细胞毒性或免疫刺激有效载荷偶联构建多药ADC的开发开始获得极大的关注。

与临床普遍应用的的小分子联合化疗类似，使用包含多种细胞毒性/免疫刺激剂有效负载的ADC进行癌症治疗涉及效力增加与毒性升高的有效平衡。为了实现这种平衡，可以采用两种策略(图1)。

①最简单的策略是将具有单一有效载荷的ADC产品与非靶向的细胞毒性/免疫刺激药物相结合；尽管这种联合给药在体外实验中显示出良好的应用前景，但临床实验结果几乎没有改善，并且毒性更高。

②因此，新的替代策略应运而生，将多种药物与同一抗体分子偶联，称为“多药ADC (multi-payload ADC)”，通过平衡剂量和合成难易性的情况下将多个有效载荷精确且受控地共同递送至靶细胞。为了克服这种联合给药，癌细胞必须同时对多种药物产生耐药机制，但产生多重耐药性的可能性很低。此外，应通过将所有药物与靶向抗体偶联来降低由多种药物剂量引起的毒性增加的风险。

多载荷ADC偶联位点的选择

这些多药ADC是使用随机和位点选择性偶联方法生成的。随机偶联方法将有效载荷添加到天然可用的氨基酸残基(Lys/Cys)中，产生具有异质性的ADC混合物。相比之下，位点特异性偶联方法可产生均质的ADC。继在Enhertu和Trodelvy这些同质位点选择性ADC获得批准并取得成功之后，出现了使用位点特异性和位点选择性偶联方法来开发新一代同质多药ADC，该类ADC具有两种或多种共价连接的独特的有效载荷。尽管多药ADC还处于起步阶段，但偶联技术的快速扩展使得同质多药ADC取得了实质性进展。最值得注意的是，与共同给药相应的单药ADC相比，同质多药ADC在肿瘤异质性和耐药性增强的异种移植小鼠模型中取得了更好的疗效和生存益处。

同质多药ADC的构建方法源于同质单药ADC偶联方法，通过使用生物偶联策略生成同质单药ADC，该策略利用蛋白质表面的氨基酸残基或携带生物正交对的非天然氨基酸(ncAA)构建均质单药ADC。此类偶联方法可以位点选择性的并靶向单一类型的氨基酸残基，或者是位点特异性的并靶向抗体中的单个氨基酸残基而不是所有其他氨基酸残基。基于已报告的大量位点选择性偶联方法，在临床环境中取得成功并在临床实践中得到证明的方法有工程化半胱氨酸、非天然氨基酸(正交对)、C/N末端、酶辅助、亲和标记、糖型改造、链间二硫键(图2)。

图2.同质单药ADC的构建方法

多载荷ADC：单位点和多位点

单独或组合使用这些偶联策略可以生成多药ADC。同质多药ADC是以位点选择性偶联的两种或多种不同有效负载。根据抗体功能化发生在单个位点还是多个位点，同质多药ADC可以分为两类(图3)。两种策略都有相应的优缺点，最终的选择将取决于有效载荷种类、不同的有效载荷数量、所需的DAR和抗体体内特性等。

单位点多药ADC的构建涉及将多功能Linekr安装到抗体上的单个位点中，这些Linker通常为分支异三功能接头，由用于位点特异性或位点选择性偶联到抗体上，通过灵活多变的分支Linker共价引入多种有效载荷(图4)。

尽管可以通过最少的基因工程或无需基因工程来生成多药ADC，但应用与抗体上的单位点偶联的多功能Linker仍存在许多限制。单位点多药ADC生成通常涉及多个纯化步骤，考虑到每次纯化都会导致产物损失和处理时间增加，这在某些情况下可能会带来很大的缺点。尽管如此，这种方法最重要的限制是固有的设计迫使附加的有效载荷彼此非常接近。鉴于化疗药物通常具有极强的疏水性，偶联位点附近导致蛋白质上出现集中的疏水性区域，并且相邻有效载荷之间可能发生非共价堆积相互作用，这会导致聚集增加以及ADC清除率相应增加，最终导致功效和安全性降低。

除了清除率增加之外，高疏水性区域还会增加体外和体内的非特异性结合。在某些情况下，高疏水性导致功效降低的问题可以通过引入更亲水的有效载荷和Linker来降低，例如通过使用扩展的PEG链或聚肌氨酸连接体来掩盖疏水性(图5)。

然而，在许多情况下，这是不可能的，因为缺乏合适的亲水性有效载荷或延伸的PEG间隔Linker，导致较差的稳定性、药代动力学行为以及超敏反应或加速血液清除的病例报告。此外，引入大体积的卷曲PEG链也会降低缀合效率，提高DAR时可能会限制支链Linker的定位到目的位置。这些原因，再加上将多个正交功能化分支Linker偶联到一个抗体分子上的可能性，导致多位点多药ADC引起了极大的兴趣。

多位点多药ADC是包含在抗体不同位点偶联的两种(或更多)不同有效载荷的抗体。此类偶联物的生成需要引入多个正交位点选择性或位点特异性蛋白质修饰策略。空间分离的有效载荷有助于克服前面讨论的单位点多药ADC遇到的疏水性和空间位阻问题。已经报道的多位点多药ADC偶联方法的组合如图6所示，每种方法都有各自的优缺点。

图6.多位点多药ADC的构建方法

尽管多药ADC取得了一定的进展，但也存在局限性。

①该领域最大的限制之一是体内生物数据的稀缺，此类研究的广度和覆盖范围有限。因此，与多种靶点/药物组合的其他治疗方案相比，对多药ADC的功效进行全面的体内评估将使该领域获益。

②另一个必须解决的领域是药物组合、协同作用和毒性的不确定性缺乏了解，再加上不可预见的毒性问题的风险，表明该领域将受益于更加关注筛选可产生协同治疗反应且毒性可耐受的ADC组合。

③探索传统有效载荷如何与不同的药物类别配对将是有益的，该领域一个不确定性是多药ADC的DAR比例是否会影响其整体效用。

④另一个需要进一步发展的领域是我们对Linker-有效载荷组合的理解，这对于单位点多药ADC方法尤其重要，该方法严重依赖精心设计的Linker来掩盖因有效载荷接近而产生的增强的疏水性。如何选择合适的构建方法，研究人员还要根据多种原则选择最适合的特定要求的偶联技术。

多载荷ADC的偶联策略对比分析

多位点多药ADC领域目前仍处于起步阶段，许多组合仍有待探索。对于ADC来说，一种方法并不适合所有情况，ADC的设计必须根据具体情况进行调整和优化。应从合成容易性、最大DAR和体内风险等进行更详细的评估。

多位点多药ADC的生产涉及多种偶联策略的顺序部署，构建这些ADC的准入壁垒通常远远高于传统的单药ADC。因此，为了使多位点多药ADC在该领域获得进一步发展，其生产的难易程度必须与单药ADC相匹配或接近。有鉴于此，对各种偶联策略的合成难易程度进行单独评估(表1)和组合评估(表2)。尽管其中许多组合尚待测试，但通过评估每种方法的化学性质和反应的条件兼容性，可以计算合成的难易程度。结果虽然并不详尽，但可以在组合之间进行相对比较。

表1.各种偶联策略的合成难易程度

表2.组合评估各种偶联策略的合成难易程度

DAR值作为任何ADC的重要参数，其对于多药ADC尤其如此，其协同功效在很大程度上依赖于实现各种有效载荷的正确比率。基于迄今为止报道的文献，各种策略组合的最大DAR和相应载荷总结在表3中。

该分析的总体趋势是高DAR偶联物主要只能通过基因工程方法的组合来获得，而不是依赖于修改天然特征的策略。例如，GlycoConnect、mTG和AJICAP的天然修饰策略都被限制在固定DAR2。与之形成鲜明对比的是，涉及基因工程的pAMF和mTG tag+297Q都提供最大可达8的可调DAR值。二硫键桥接技术提供了一个中间立场，无需基因工程即可提供固定的DAR4。

因此，各种方法的组合应用允许生成具有4-16可调DAR值的多位点多药ADC。最合适的组合将取决于最终用途和所用有效载荷的效力。

近年来蛋白质生物偶联技术的突破使得均质ADC得到迅速发展，目前已有多款产品进入临床。基于位点特异性蛋白质化学的持续发展以及对具有改善的治疗窗口和简化的制造的靶向治疗的需求不断增长，均质ADC的发展得到越来越多的关注。

然而，鉴于肿瘤以异质细胞群的形式存在(每个细胞群具有不同的药物敏感性)，已经进一步转向生成同质的多药ADC，从而允许使用不同MoA共同递送两种或多种互补药物。与相应的单药ADC的共同给药相比，其体内治疗效果和生存获益更大。然而，相对于单功能化，抗体的双功能化仍然是一个挑战，因为抗体表面上有过多的反应性官能团，并且需要高效率地发生不同正交反应的组合。

参考资料：

[1] Journeaux, T., Bernardes, G.J.L. Homogeneous multi-payload antibody–drug conjugates. Nat. Chem. (2024). https://doi.org/10.1038/s41557-024-01507-y

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