cis-双抗：将双抗开发推向新的高潮！

双特异性抗体（bsAbs）因为其独特的MOA使其能够发挥单抗不具有的功能，而且已经在临床中取得了巨大的成功，特别是在血液瘤中。目前已经有10多款双抗获批上市，用于肿瘤，眼科疾病，血友病等的治疗。这些获批的抗体多数是靶向TCE的双抗，也就是trans-targeting双抗，其作用于两个不同的细胞，并利用其中T细胞对另外一个肿瘤细胞进行杀伤。不同于trans-targeting双抗，目前获批的cis-targeting双抗相对较少，然而cis-bsAbs共靶向同一细胞表面的两个靶标的策略，具有trans-targeting不具备的一些功能，如诱导接近、增强对目标的结合、提高目标/细胞选择性，并/或在细胞表面共同调节功能，从而改变、逆转或根除促成疾病的异常细胞活动。

迄今为止，已有三种cis-bsAbs（Emicizumab、Amivantamab和卡度尼利单抗/cadonilimab在非癌症和癌症适应症中获得批准（见表1）。Emicizumab目前在市场上用于治疗血友病A，并模拟因子VIII（在血友病A患者中缺失）的功能。这种分子通过共靶向因子IXa（FIXa）和因子X（FX），促进它们的相互作用及随后生成活化的FX（FXa），这是血液凝固途径中的一个后步骤。

 

Amivantamab被批准用于治疗携带EGFR外显子20突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者，这些患者在铂类化疗后或治疗过程中病情进展。Amivantamab靶向表皮生长因子受体（EGFR）和肝细胞生长因子受体（MET）；这两种受体酪氨酸激酶在肿瘤细胞上经常过度表达，并通过共信号作用影响癌细胞环境中的抗性机制。通过共靶向EGFR和MET，Amivantamab通过包括双重配体-受体阻断、双重受体介导的内吞作用和抗体介导的细胞毒性（ADCC）在内的一系列机制诱导肿瘤细胞死亡。

 

卡度尼利单抗是另一种获批的cis-bsAb，它共靶向T细胞上CTLA4和PD-1，卡度尼利单抗在中国被批准用于治疗复发或转移性宫颈癌患者，这些患者在铂类化疗后病情进展。抗PD-1和抗CTLA4单抗联合给药的组合策略虽然有效，但在难以治疗的癌症中也表现出增加不良事件的发生率。卡度尼利单抗是由康方生物开发的四价bsAb。这种四价格式利用了肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）上PD-1和CTLA4共表达的增加，相比外周T细胞，实现了通过增加亲和力增强的TILs结合选择性。虽然这种bsAb可能通过顺式靶向PD-1和CTLA4发挥作用，但也观察到它通过反式结合实现了T细胞交联。值得注意的是，其他针对PD-1和CTLA4的顺式双特异性努力也显示出类似的T细胞激活增强。

同时靶向一个细胞表面扩展驱动一个或多个治疗作用模式的能力，包括介导协同抑制、促进目标锚定和增强目标内吞。此外，使用AND逻辑，即需要两个不同目标的同时结合才能产生新的功能，进一步扩展了顺式双特异性抗体的治疗能力。近年来，研究者还开发了新的顺式双特异性抗体介导的诱导接近方法，以增强选择性目标降解或诱导翻译后目标修饰（图3）。

顺式双特异性抗体共靶向在受体酪氨酸激酶（RTK）靶标中最常见，这主要是靶向单个靶点的抗体，如西妥昔单抗（EGFR）或曲妥珠单抗（受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2 [HER2]）等，尽管它们在临床上取得了成功，但由于其他RTK的补偿性活性或获得性依赖性，经常显示出有限的疗效。早期的顺式双特异性抗体例子包括共靶向erbB-3（HER3）与EGFR、HER2或胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）。选择HER3作为共抑制靶点是因为在临床研究中发现，对RTK抑制耐药的肿瘤中HER3信号通路的补偿和/或激活。临床前研究中，HER3-EGFR/HER2/IGF1R共靶向显示出比单独靶向更强的肿瘤杀伤。另外，这些双抗具有不同的结构，也表明协同抑制与多种双抗结构的兼容性。重要的是，基于顺式双特异性抗体的协同抑制在临床上取得了成功，例如Amivantamab（用于非小细胞肺癌中EGFR和MET的双重靶向。

 顺式双特异性抗体已成功地用于利用一个高度表达目标的结合作为锚点，以增强对第二目标的结合和调节（第二目标表达较少）Zenocutuzumab（MCLA-128）通过共靶向细胞表面的HER2和HER3，利用了这种机制。这种双特异性抗体使用“对接和阻断”机制，其中HER2结合臂首先结合在更丰富的HER2蛋白上，从而将HER3结合臂定位在HER3上，并阻断NRG1的结合。这种相互作用阻止了NRG1介导的HER3与HER2和其他RTKs的异二聚体化，从而阻碍了下游信号传导。Zenocutuzumab的显著临床活性已导致其获得治疗NRG1融合阳性实体瘤的突破性疗法认定。

 

另一个锚定的例子包括针对MET和EpCAM（MM-131）的顺式双特异性抗体，以增强对MET的阻断。利用高度表达的EpCAM作为锚点，增加了双特异性抗体的局部化，从而实现了与单独靶向MET相比增强的MET信号结合和拮抗作用。在使用肿瘤抗原EPHA2，ICAM-1和ALCAM作为顺式双特异性抗体共靶点以增强对低密度脂蛋白受体相关蛋白6 (LRP6)的结合和抑制Wnt信号传导方面，也观察到了类似的趋势。在这项研究中，对LRP6和肿瘤相关抗原（TAAs）具有低至亚纳摩尔结合能力的顺式双特异性抗体，与单独靶向LRP6相比，Wnt抑制作用增强了100倍以上。值得注意的是，随着肿瘤抗原与LRP6的表达比率增加，这种抑制效应增加，进一步展示了锚定效应在抑制LRP6能力上的作用。

高EGFR表达也被利用来增强PD-L1的共靶向抑制，以阻断PD-1在T细胞上的PD-L1相互作用。 研究者利用对PD-L1和EGFR的低纳摩尔结合臂配对，导致与PD-L1的结合亲和力在癌细胞上对照增加了140倍。这种双特异性抗体介导的增加对PD-L1亲和力可能由EGFR相对于PD-L1的过量表达驱动，促进了依赖EGFR锚定的PD-L1结合。进一步研究表明，PD-L1的EGFR双特异性抗体能够实现PD-L1和EGFR的协同抑制，共同增强T细胞活性并抑制肿瘤生长。

差异的共目标表达靶点的内吞也可以利用双抗进行调节，例如，一个由EphA2和ALCAM组成的双特异性抗体，分别具有内吞和非内吞结合臂，研究表明，任一目标的内吞都可以由EphA2和ALCAM的相对表达比例调节。当EphA2与ALCAM的比例高于1:5的阈值时，非内吞ALCAM的内吞增加。然而，当受体比例低于此阈值时，EphA2的内吞从快速变为较差。增强内吞的作用在ADC的开发中具有更大的潜力，与单靶点ADC相比，增强内吞的双抗ADC可能具有更强的肿瘤细胞杀伤活性。

 

双特异性抗体提供另一种增强目标内吞作用的方法。这类双特异性抗体通过识别同一目标上独特的、不重叠的表位来发挥作用。针对不同表位的靶向使得差异化的作用机制成为可能，包括增强的聚集和内吞作用、选择性细胞靶向、增强的细胞毒性以及增加的受体激动/拮抗作用。例如，HER2双特异性抗体zanidatamab（ZW25）结合了HER2上的不同表位，与单一表位靶向的单克隆抗体相比，促进了显著更高的HER2交联和内吞作用。ZW25还诱导受体下调，并增加了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。由双特异性抗体介导的增强内吞作用使得这成为一个吸引ADC策略的领域，导致许多双特异性抗体/双特异性抗体ADCs正在进行临床开发。

顺式共靶向还实现了AND逻辑门控，其中同一目标细胞上的两种抗原的同时结合驱动单一的功能输出。HexElect就是这样一个例子，当两种蛋白质在同一细胞上结合时，会形成一个异源六聚体mAb复合物，并促进下游信号传导。在CD52和CD20抗体的Fc区域引入了六聚体增强突变，以便只有在两种抗体都结合到同一细胞时才能形成异源六聚体复合物，从而作为生物学上的逻辑AND门。通过这种方式，相互依赖的抗体对只在两种靶标都表达的细胞上将两个抗体结合信号整合成单一的功能输出。这种设计不同于依赖于亲和力优化以实现选择性结合的共价连接多特异性抗体，后者经常因靶标表达的异质性而变得复杂。在HexElect这个例子中，应用抗体混合物的非共价方法意味着抗体结合可以从功能激活中解耦，从而提高治疗指数。由于需要结合两种靶标，这种顺式激活效应可能由两种表面靶标中较少的一种驱动，与利用相对靶标丰度的锚定策略不同，这为其他AND逻辑门控应用开辟了新的机会，包括促进目标细胞选择性和/或激活。

功选择性地蛋白质降解和对难以药物化的目标进行持久性抑制，导致了大量内源性和外源性蛋白质降解策略和模式的涌入。基于抗体的降解策略已经利用了靶向溶酶体的途径，将细胞表面蛋白引导至溶酶体进行降解。其中包括由糖苷共轭抗体组成的抗体基溶酶体靶向嵌合体（LYTACs），它们共同结合一个表面靶标和一个溶酶体导向表面受体（非甘露糖-6-磷酸受体[CI-M6PR]或肝特异性天冬酰胺酶糖蛋白受体[ASGPR]）以实现溶酶体转运和随后的降解。

 

基于双特异性的方法也已经开发出来，用于直接将表面蛋白输送到溶酶体，包括针对细胞因子受体的嵌合体（KineTACs），它们包含一个CXCL12趋化因子臂和一个Fab臂，用于靶向感兴趣的表面蛋白以进行降解。总体而言，溶酶体靶向设计已经在具有高临床兴趣的目标类别中展示了广泛的适用性，包括受体酪氨酸激酶、检查点受体/配体和肿瘤相关抗原（TAAs）。

 

通过跨膜E3连接酶的靶向蛋白降解也已经通过多种努力得到证明，包括以抗体为基础的蛋白酶体靶向嵌合体（PROTACs）被称为AbTACs、蛋白酶体靶向抗体（PROTABs）和通过E3泛素连接酶招募受体消除（REULR）。这些方法利用顺式双特异性抗体将表面E3连接酶招募到感兴趣的目标上，以促进目标泛素化和随后的蛋白酶体降解。通过这些AbTAC/PROTAB/REULR努力，已经展示了多种E3连接酶（例如，RNF43、ZNRF3、RNF128、RNF130、RNF133、RNF149和RNF167）能够驱动包括EGFR、HER2、PD-1、PD-L1和IGF1R在内的广泛治疗相关表面受体的降解。然而，尽管靶向降解可能在目标上具有广泛的适用性，但识别E3连接酶和感兴趣的目标在细胞和组织中充分和/或选择性共表达的地方仍然是这种方法成功的关键因素。同样重要的是要注意，除了消除细胞表面蛋白的bsAb降解剂方法外，其他bsAbs也可以通过内吞作用促进细胞表面目标的移除。

随着双特异性抗体靶向治疗的成功，许多顺式双特异性抗体正在临床前或临床开发中。表2突出了目前正在临床研究中的顺式双特异性抗体。迄今为止，顺式靶向双特异性抗体的临床景观主要集中在肿瘤和免疫细胞环境，以及利用细胞毒性有效载荷增强肿瘤细胞杀伤。如前所述，受体酪氨酸激酶（RTKs）在促进细胞信号传导和/或促进肿瘤生长的串话中起着关键作用，并且是顺式双特异性抗体的强烈关注领域。为此，几种临床策略正在追求顺式靶向两种不同的RTK（例如，EGFR和cMET或EGFR和HER3）或对一个RTK的双特异性方法（例如，HER2和HER2）（表2）。同样，由于免疫检查点治疗的临床成功，也在多个免疫肿瘤学环境中探索了双重靶向策略（例如，PD-1和CTLA4或PD-1和淋巴细胞激活基因3 [LAG3]）以调节免疫检查点信号传导（表2）。ADCs在靶向癌症治疗中的复兴和日益增长的热情激发了设计顺式双特异性ADCs的努力，目标是通过改进ADC特异性和/或内吞作用来减少目标上、肿瘤外的毒性。因此，目前正在进行多个双特异性ADCs的临床试验，包括针对不同肿瘤抗原的顺式双特异性ADCs（例如，AZD9592 [EGFR和cMET]和BL-B01D1 [EGFR和HER3]）或双特异性双特异性抗体ADCs（例如，ZW49（ZW25的ADC）和KM501 [HER2和HER2]）（表2）。来自BL-B01D1的初步临床数据显示了在患者中的高总体反应率（ORR）。鉴于这一初步成功，共靶点选择和仔细设计的顺式双特异性抗体格式/亲和力（在下文中讨论）将是顺式双特异性ADCs作为可行的治疗靶向策略迅速出现的关键因素。

CIS-双特异性抗体（cis-bsAb）的开发和其它双抗的抗体一样，都有些比较关键的因素，包括（1）全面了解相关靶点在细胞表明的表达丰度；（2）需要了解共靶细胞表面微环境（3）优化cis-bsAb设计/选择标准以实现共靶调节（即亲和力、格式、表位和功能）。

了解膜蛋白的丰度和动态对于在疾病环境中实现靶标发现至关重要。传统上，基因表达分析一直被用于检测相关靶点在正常与疾病组织环境中的差异表达。但是这些常规的检测方法有一定的缺陷，如，哺乳动物的mRNA水平经常与蛋白质水平不一致（见图4A）。导致这种差异的因素包括蛋白质与mRNA检测方法的不同敏感性、蛋白质和mRNA水平之间的大动态范围变化、基因/蛋白质特异性调控以及/或翻译后或转录后修饰。在癌症等疾病环境中，染色体异常可能导致DNA拷贝数的扩增和/或删除。与mRNA相比，这种差异在相应的蛋白质水平上更为明显。此外，mRNA表达并未提供有关细胞定位的信息，这对于确定蛋白质是否可以在细胞表面被靶向至关重要。当选择细胞表面双cis靶向的靶标时，这些信息尤其重要，因为其会影响cis-bsAb功能。因此，在以mRNA表达作为选择表面蛋白靶标时，应谨慎行事。由于mRNA表达数据与蛋白质丰度和定位相对应的挑战和限制，人们越来越倾向于获取和依赖基于成像和蛋白质组学的分析，以量化蛋白质丰度、相对表达和位置，如如免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）以及下一代IHC（结合质谱的IHC）等，可以揭示患者肿瘤样本之间以及同一肿瘤内部的异质性蛋白质表达。

细胞表面蛋白质微环境的洞察是发现下一代CIS-双特异性抗体（cis-bsAbs）的关键组成部分。CIS-双特异性抗体针对的是细胞膜微环境，这是一个密集的蛋白质阵列，其蛋白质含量至少与脂质含量相当。与细胞质环境不同，存在于二维膜中的蛋白质在横向运动上受到限制，仅有2°的平移自由度，并且旋转运动受到高度限制。这种横向蛋白质运动在很大程度上受到与脂质膜的相互作用以及与细胞骨架和细胞外基质的外围相互作用的影响。在这个膜环境中，表面蛋白质的整体架构由表面蛋白质与脂质成分之间的异质性相互作用驱动，形成不同大小（10-200纳米）、组织结构和侧向动态的区域化脂质筏域。在这些聚集区域内，表面受体和其他相关蛋白质在不同的脂质环境中组装，形成蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂质相互作用，影响蛋白质的共功能和信号传导。蛋白质定位到脂质筏环境中是动态的，通常取决于细胞类型或激活状态。因此，根据局部蛋白质微环境的不同，表面蛋白质可能在膜内具有不同的移动或相互作用能力，这可能影响CIS-双特异性抗体的靶向效果。细胞表面蛋白质的定位和分布也可以通过促进/维持细胞结构和/或与邻近细胞的相互作用的细胞过程来调节，为CIS-双特异性抗体治疗靶向提供了额外的机会。例如，上皮细胞由不同的顶端、侧边和基底外侧区域组成，表面蛋白质不对称地分布以维持细胞极性和稳态。紧密连接蛋白等因子在侧边区域的失调导致去极化/再极化事件，丧失细胞间粘附，并促进肿瘤表型和转移。由于这种重构导致的蛋白质错位已经被成功地用于基于抗体的治疗靶向。

细胞-细胞相互作用也驱动了细胞表面蛋白的定位。显著的细胞-细胞相互作用的例子包括免疫突触、神经元突触和上皮连接（图4C）。在这些环境中的蛋白质可能参与顺式和反式相互作用，以推动关键的信号传导和共信号传导过程。在免疫细胞的背景下，观察到许多顺式相互作用的例子，包括：淋巴细胞抗原49A（Ly49A）与主要组织相容性复合体I类（MHC-I）、B和T淋巴细胞抑制剂（BTLA）与肿瘤坏死因子受体超家族成员14（HVEM）、PD-L1与PD-1和CD80、CD2与CD58，以及CD80/86与CTLA4和CD28。鉴于在细胞-细胞相互作用环境中靶向蛋白质的临床成功，顺式靶向细胞-细胞突触中或形成这些突触的细胞上的蛋白质复合体，提供了一个有吸引力的基于CIS-双特异性抗体的策略。重要的是，表面蛋白环境在疾病与正常状态下的表达和定位不同。在癌症环境中，与正常细胞相比，肿瘤细胞表达更高的膜蛋白（例如肿瘤相关抗原，TAAs）已经引起了使用基于抗体策略的越来越多的治疗兴趣。

然而，在靶向TAAs的一个主要挑战是它们通常也存在于正常组织上，增加了靶向肿瘤外毒性的风险（图4D）。已经确定，与TAAs相邻或共表达的肿瘤相关邻近抗原（TAPAs）有可能为肿瘤与正常细胞的靶向提供额外的选择性维度（图4D）。到目前为止，通过双特异性抗体或双特异性抗体药物偶联物（bsAb ADCs）共靶向共表达的表面蛋白是一种新兴的治疗策略，目标是提高选择性肿瘤杀伤。

CIS-双特异性抗体的设计、发现和开发与靶标选择过程相互依赖，需要仔细评估和选择以获得最佳治疗效果。CIS-双特异性抗体设计需要考虑的关键因素，包括：(1) 双特异性结构；(2) 对靶标的亲和力；(3) 抗原表位和共靶标结合几何学；以及(4) 筛选方法。

关于双特异性抗体结构，目前已经有超过100种，包括IgG-like和非IgG，以及形成异二聚体等。这些结构一直在不断的扩展改进，以适应包括大小、亲和力、长度、灵活性、价态、药代动力学特性和可开发性要求。关于这一方面，已经有很多文献案例报道，这里不再赘述。

 

在临床开发方面，无论是IgG-like还是片段都已经获得了成功，而目前在临床上进展的CIS-双特异性抗体主要是基于IgG的支架。而具体到如何选择最终的抗体结构，其实和多种因素相关，包括1）：靶点的选择；2）MoA, 例如，配体-受体阻断、内化、锚定、诱导接近）以识别具有优化属性的格式，以实现期望的MoA（例如，价态、链长度、亲和力）；3)靶标微环境（例如，细胞-细胞突触、局部pH、富含蛋白酶）以构建可容忍的大小、稳定性、pH依赖性结合或激活特性；4)双特异性抗体的药代动力学需求，以便从具有兼容半衰期范围和可开发性。

从亲和力对于CIS-双特异性抗体来说具有重要意义，其中结合受到细胞表面共靶标抗原密度和相对比例的严重影响，因为这些特性可以直接用于增强目标参与和结合选择性。亲和力的重要性已经在上市的多个抗体中得到体现，如强生的EGFR/cMET，而且很多研究也证明，亲和力在抗体安全性方面也有很重要的作用。

CIS-双特异性抗体设计过程中的另一个重要组成部分是抗体结合抗原的表位。抗体的结合位置可能直接具影响抗体的功能（例如激动或拮抗）以及/或者通过结合诱导的内化改变表面水平。此外，抗体结合到细胞外域的膜远端或近端区域也可能影响活性。例如，识别PD-1膜近端区域的抗PD-1抗体作为PD-1激动剂，抑制T细胞激活。相比之下，结合膜远端区域并阻断PD-L1/2参与的抗PD-1抗体导致途径抑制和T细胞激活。

此外，表位选择可以在两个不同的蛋白目标上发挥作用，以提供理想的几何学，将双特异性抗体定位以交联（即，将两种蛋白质带入物理相互作用的距离），已经上市的Emicizumab就是很好的例证。

筛选方法在CIS-双特异性抗体的筛选中也具有举足轻重的作用。Emicizumab需要模拟FVIII的功能，200种针对FIXa和FX的单克隆抗体在knob-in-hole IgG2或IgG4格式中进行了组合配对（总共40,000个双特异性抗体），并在酶促反应中筛选活性。从这个筛选中，94个双特异性抗体显示出活性，并进一步优化以提升双抗的可开发行。对于Amivantamab的筛选，主要目标是识别能够在血浆水平浓度下实现单价目标结合且最小化EGFR或MET激动的抗体。在这个筛选中，首先对五个MET和八个EGFR结合物进行了适当的亲和力测定，然后对EGFR和MET抗体配对，筛选不激活MET的组合。随后再筛选可以抑制细胞增殖和不会活化EGFR磷酸化的双抗，从而确定最终的双特异性抗体。Zenocutuzumab（HER2/HER3），是通过基于功能的高通量筛选获得的。

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