细胞外基质（ECM）不仅是组织特异性不可或缺的决定因素，而且还是用于三维 (3D)细胞培养目的的有吸引力的生物材料支架。为了支持3D培养，合成水凝胶必须(1)呈现整合素结合配体，(2)易受蛋白酶切割，(3)表现出类似组织的粘弹性。
传统上，此类水凝胶是通过共价或非共价交联由亲水性聚合物制备的，所得网络结构相对静态和均质，无法在空间和时间上引发所需的细胞反应。因此，成功设计功能性组织需要开发创新的水凝胶平台，以重现天然ECM中看到的空间异质性和时间动态，从而允许在3D活细胞培养过程中精确控制驻留细胞的表型、命运和行为。
最近的文献见证了“动态、适应性强、反应灵敏”的水凝胶系统发展的爆炸式增长，该系统允许用户在空间和时间上直接操纵化学和机械线索。这种可调性是通过使用动态共价化学或独立生物正交化学的组合实现的。响应外部刺激，例如温度、pH值的变化以及离子、酶、光、自由基或机械力的引入，在已建立的3D网络内发生额外的交联、降解或共轭。此外，基于光的化学反应与双光子吸附或体积打印相结合，实现了具有高时空精度的用户指导基质修改。虽然这些策略被广泛使用并且通常有效，但对外部触发因素的依赖会带来潜在的毒性问题。在某些情况下，用于实现材料特性所需变化的化学反应是缓慢、低效、可逆的且不是真正的生物正交的，这使得正在解决的生物学问题复杂化。
基于此，来自美国特拉华大学（University of Delaware）的Xinqiao Jia团队开发了一种新策略，使用一系列生物功能化的工具分子来建立合成ECM，这使得合成ECM的组成和力学可以在没有任何外部触发的情况下在空间和时间上进行调整。相关成果以“Bio-orthogonal tuning of matrix properties during 3D cell culture to induce morphological and phenotypic changes”为题于2024年11月5日发表在《Nature Protocols》上。
该水凝胶构建块（图1）包括快亲二烯体(反式-环辛烯trans-cyclooctene, TCO)TCO标记的整合素结合肽(RGD-TCO)以及非粘附性对照RGE-TCO、易受基质金属蛋白酶(MMP)介导的裂解的慢亲二烯体(降冰片烯norbornene, Nb) Nb功能化肽交联剂(SMR-bisNb)以及生物正交四嗪tetrazine (Tz)和TCO修饰的透明质酸(HA-Tz和HA-TCO)。
图1 基质特性的生物正交调节
用户控制的基质重塑可以随时启动，持续时间任意，从而为凝胶提供基质特性的空间变化。由于凝胶化受扩散控制，TCO浴成分的变化以受时间控制的空间方式反映在交联凝胶中。之前的研究通过交替将部分交联的HA凝胶微球暴露于带或不带荧光标签(Alexa-TCO)的双TCO交联剂浴中(图2b、d-g)说明了这一概念(图2a)。通过使用注射泵随时间逐渐增加染料浓度，可以轻松创建具有荧光标签径向梯度的微球(图2c)。理论上，通过在交联过程中时间控制引入多种TCO物种可以生成更复杂的图案。
图2 生物正交Tz连接可以制造具有化学线索空间变化的水凝胶
随后，作者展示了如何通过这种生物正交化学反应，在水凝胶中创建具有不同刚度区域的结构。这一方法的核心在于，水凝胶中的刚度变化是通过四氮唑和不同速率的双烯烃反应进行调控的。通过控制反应的空间分布和反应速率，研究人员能够在水凝胶的不同区域形成刚度梯度，从而模拟不同的机械环境。
图3 生物正交Tz连接可以制造具有空间刚度变化的水凝胶
基于该技术，作者进一步展示了模拟三维组织模型的创建、上皮-间质转化（EMT）模型的开发与表征、应激-重编程（SCR）模型的开发和表征、MAT（机械转化、肿瘤微环境）模型的开发与表征等。具体工作如下：
（1）模拟三维组织模型的创建：作者进一步展示了一个从基质构建、细胞接种、培养调控到最终表征与分析的完整流程。该工作流程的核心目的是利用可调控的三维水凝胶平台，创建生物相容性强、能够模拟真实生物环境的三维组织模型（图4）。
图4 3D组织模型的开发和表征工作流程
（2）上皮-间质转化（EMT）模型的开发与表征（图5）：在细胞接种并培养在三维水凝胶基质后，研究者通过添加诱导因子（如TGF-β等）来诱导上皮-间质转化（EMT）。通过显微镜技术（如共聚焦显微镜）对细胞形态进行观察，可以定性分析细胞从上皮样细胞向间质样细胞转化的过程。上皮细胞通常具有紧密的细胞连接，而间质细胞则表现出更高的迁移性和扩展性。在水凝胶中，细胞的形态学变化能够反映出它们是否发生了EMT；还可以通过免疫荧光染色或Western blot等技术，检测EMT过程中的分子标志物。
图5 EMT模型的开发和特性
（3）应激-重编程（SCR）模型的开发和表征：通过调节水凝胶的物理和化学特性并引入应激因子，能够模拟细胞在不同应激条件下的行为探索其重编程过程（图6）。与上述过程类似，在SCR模型中，通过引入特定的应激因子（例如氧化应激、机械应激等）来激活细胞应激反应。应激因子的加入会触发细胞的应激反应通路，这可能影响细胞的代谢、增殖、迁移及分化状态。在三维水凝胶环境中，细胞对应激的反应可能与二维培养系统中的反应不同，因此，该模型能够提供更多有关细胞在三维环境中如何响应应激的细节。
图6 SCR模型的开发和特性
（4）MAT（机械转化、肿瘤微环境）模型的开发与表征：主要通过精确调控水凝胶的刚度来模拟肿瘤微环境中的机械信号（图7）。通过这种方式能够研究肿瘤细胞在不同机械条件下的行为，如增殖、迁移、侵袭等；该模型为探索肿瘤细胞如何响应微环境中机械信号提供了一个有力的实验工具。
图7 MAT模型的开发和特性
综上，本文提供了关于模块化水凝胶构建块的合成、初始水凝胶的开发以及随后通过界面生物正交连接对水凝胶进行改性以及细胞构建体的建立和表征的分步说明。本文的关键点主要有（1）该方案描述了一种生物正交方法，用于在三维培养过程中以时空方式动态改变合成细胞外基质的粘附性或硬度，以诱导表型变化并产生功能性组织；（2）该方法不干扰天然生物过程，也不需要外部触发或环境变化。因此，它更类似于天然的细胞外环境，并且易于实施。
总的来说，通过开发和应用一个高度可调控的三维水凝胶平台，研究人员能够精确模拟细胞在动态微环境中的行为变化，并利用这一平台研究不同疾病过程及其治疗方法。这为疾病机制的深入理解、药物筛选、个性化治疗以及再生医学等领域开辟了新的研究路径。
文章来源：
https://doi.org/10.1038/s41596-024-01066-z
