生物活性水凝胶已成为增强干细胞介导的肌腱修复的潜在人工微环境。然而，关于微环境特征的最佳组合以实现靶向细胞反应的知识缺口很大，这通常会导致漫长的开发周期和不受控制的愈合结果。
为了解决这一关键差距，来自香港中文大学医学院的Dan Michelle Wang/Rocky S. Tuan团队开发了一种创新的数据驱动材料组学策略。这种方法基于内部RNA测序数据，整合了生物信息学和数学建模，与传统的反复试验方法有很大不同。它旨在提供机制见解以及对由肌腱模拟水凝胶(TenoGel)的系统调节特征诱导的脂肪来源干细胞的肌腱形成效应的定量评估和预测。研究优化的TenoGel在体外表现出强大的肌腱生成，并促进肌腱再生，同时防止大鼠肌腱损伤模型中出现不良异位骨化。
相关研究成果以“Transcriptome-Optimized Hydrogel Design of a Stem Cell Niche for Enhanced Tendon Regeneration”为题于2024年10月17日发表在《Advanced Materials》上。
方案1 研究目标和概述。
A）研究目标：对材料生态位特性如何影响细胞反应的理解有限，导致开发周期过长，治疗结果不可预测且不受控制。为了应对这一挑战，“材料组学”已成为一种强大的数据驱动工具，可用于整个生物材料开发流程，克服了传统经验方法的局限性，并能够合理设计具有增强治疗效果的生物材料。
B) 研究概述：材料组学策略基于内部RNA测序数据，由两个主要部分组成。首先，作者使用生物信息学对细胞对不同水凝胶特征的反应进行机制研究。其次，开发数学模型来定量评估和预测水凝胶设计的肌腱生成效应。从材料组学评估中产生的知识最终将为TenoGel设计带来一种高效、有针对性的方法，并提高其对干细胞介导的肌腱再生的功效。
1.GelMA/OA作为开发TenoGel的合适生物材料基础
GelMA/OA是通过明胶甲基丙烯酸酯和氧化海藻酸钠的复合制备而成，这种结构设计使得材料具有优异的机械性能和生物相容性（图1A）。FTIR确认了GelMA和OA之间发生席夫碱反应证实了化学交联的成功（图1B）。材料的力学性能，如拉伸模量和最终拉伸应力，显示该材料具有良好的机械强度，适合用于体外张力加载环境（图1C）。通过降解动力学和扫描电子显微镜（SEM）图像展示了材料在PBS中长期孵育后的缓慢降解性和结构稳定性，证实了其适用于长期生物医学应用（图1D）。此外，通过活/死细胞染色和MTS测定展示了GelMA/OA支持hASCs高存活率和增殖的能力，证明了其良好的细胞相容性和促进细胞生长的潜力。
图1 GelMA/OA水凝胶的体外表征
2.TenoGel作为肌腱模拟水凝胶微环境
作者详细讨论了TenoGel作为肌腱仿生水凝胶生态位的设计和功能，特别强调了通过系统调控tECM（肌腱细胞外基质）和单轴张力加载来模拟肌腱的生理环境，旨在优化肌腱再生。首先，本节通过介绍TenoGel设计的总体策略和组成，强调了tECM和单轴张力加载在调控脂肪源间充质干细胞（ASCs）向肌腱细胞分化中的关键作用。TenoGel利用了tECM的生物活性以及物理加载的影响，通过这两种方式共同作用，增强了干细胞的肌腱生成潜力（图2A）。tECM可以被成功地整合入GelMA/OA水凝胶中，并且能在体外条件下实现持续释放，这对于维持长期的生物刺激是至关重要的（图2B）。通过有限元分析（FEA），文章验证了在张力加载下水凝胶经历的应力分布，确保了细胞能够均匀地受到机械刺激（图2C）。这种精确控制的物理环境为ASCs提供了必要的机械信号，促进了其向肌腱细胞的转化。最后，通过LIVE/DEAD染色和细胞骨架及核染色的结果，展示了TenoGel在不同培养条件下（如静态培养、单独使用tECM、单独进行加载以及tECM和加载联合使用）的细胞存活率和形态变化（图2D和图2E）。综上所述，TenoGel水凝胶作为肌腱仿生生态位的开发与应用，特别是其在系统调控关键生物化学和生物物理参数方面的创新方法，为肌腱再生提供了有力的技术支撑。
图2 tECM和单轴拉伸载荷是TenoGel的两个关键特征
3.hASC肌腱发生的转录与TenoGel生态位特征高度相关
接着，作者进一步探讨了肌腱仿生水凝胶TenoGel中不同设计特性对脂肪来源的间充质干细胞（hASCs）肌腱生成转录谱的影响。作者通过转录组分析深入揭示了TenoGel环境特性如何调控hASCs的基因表达，并推动其向肌腱细胞的分化。
首先，通过主成分分析（PCA）展示了tECM和单轴张力加载如何影响hASCs的整体转录变化。PCA结果揭示了在不同时间点tECM和加载联合使用与其他组（如控制组、单独tECM使用组和单独加载组）之间的显著差异，这表明tECM和机械加载的组合对hASCs的基因表达具有深远影响（图3B）。通过差异表达基因（DEGs）分析，进一步确认了tECM加加载条件下hASCs展示了与肌腱相关的基因表达增加。特别是，tECM和加载共同促进了如scleraxis（SCX）、collagen type XI alpha 1 chain（COL11A1）等关键肌腱标记基因的表达（图3C和图3D）。这些基因的表达模式强化了TenoGel设计参数在促进肌腱特异性基因表达中的作用。此外，通过热图分析和基因集富集分析（GSEA）对hASCs在不同TenoGel条件下的细胞命运做了详细的表型描述。分析结果显示，tECM与加载的联合使用在促进肌腱分化方面效果最为显著，而单独加载则可能诱导一定程度的成骨分化，这一发现对于优化TenoGel设计具有重要指导意义（图3E和图3F）。
图3 响应不同TenoGel设计的hASC谱系分化的转录分析
4.评估和预测TenoGel设计对hASC肌腱生成和骨生成的影响的数学模型
作者讨论了如何使用数学模型来评估和预测TenoGel设计对人脂肪源间充质干细胞（hASCs）肌腱生成和骨生成分化的影响。通过构建和应用不同的数学模型，本节深入分析了TenoGel中tECM和单轴张力加载等关键设计参数对hASCs分化路径的调控作用。
首先，利用来自不同TenoGel条件下的转录组数据，构建了随机森林（RF）和线性回归（LR）模型，以预测和评估tECM和张力加载对hASCs肌腱生成和骨生成影响的效果。模型分析显示，在肌腱生成预测方面，LR模型表现出较高的预测准确性（图4C）。通过使用这些模型，文章详细展示了tECM和张力加载的协同作用对hASCs分化方向的影响。特别是，tECM在促进肌腱生成方面起到了更为显著的作用，而单独的张力加载则在一定程度上促进了骨生成。这些发现帮助优化了TenoGel的设计，确保其在肌腱再生应用中的效能最大化（图4D和图4E）。此外，模型分析还揭示了预处理持续时间对hASCs分化影响的重要性，强调了选择适当的培养时间对于实现理想的细胞表型至关重要。这一部分通过详尽的数据分析强调了在设计肌腱再生支架时，对细胞分化环境的精确控制的必要性。
总体而言，通过构建和应用数学模型，为TenoGel的设计提供了量化的评估和预测工具，使得肌腱和骨生成的生物工程策略能够更加精准和有效。这些分析不仅加深了对TenoGel设计参数影响hASCs行为的理解，也为未来的生物材料设计提供了重要的科学依据。
图4 TenoGel设计参数对hASC转录组影响的数学建模及评估
5.TenoGel与tECM和单轴拉伸负荷协同促进体外hASC肌腱生成
在此部分，作者通过一系列实验验证了TenoGel设计参数对hASCs肌腱分化能力的实际影响，并展示了相关的实验数据和分析结果。通过实验数据显示，在结合tECM和单轴张力加载的条件下，hASCs显示出显著增强的肌腱相关基因表达，如scleraxis（SCX）和collagen type I alpha 1 chain（COL1A1），这些基因的上调表明TenoGel设计能有效促进肌腱细胞特征的形成（图5B）。这些结果通过定量PCR（qPCR）分析得到验证，进一步强调了tECM和机械加载在促进肌腱分化中的协同作用。
此外，通过免疫荧光（IF）染色技术，观察了肌腱细胞特异性蛋白如tenomodulin（TNMD）的表达，证实了在tECM和张力加载共同作用下，hASCs在肌腱细胞分化方面表现出更强的活性（图5A）。作者还评估了TenoGel设计对hASCs在体外培养中的长期影响，通过老化相关的β-galactosidase（SA-β-gal）染色分析，评估了细胞老化的程度。结果表明，在经过长时间培养后，tECM和张力加载能显著减缓细胞老化过程，支持了这种设计在维持细胞活性和功能方面的潜力（图5D）。
图5 优化TenoGel设计的体外分析
6.TenoGel促进了大鼠肌腱缺损模型中的干细胞活力和保留并增强肌腱再
为了评估体外预处理的ASC-TenoGel的肌腱愈合效果，作者进一步利用了大鼠髌腱损伤模型(图6A)。为了评估植入的rASC的活力，在多个时间点监测了DiR标记的rASC的荧光强度，包括植入前第0天，以及植入后第1天和第 1、2、4、6和8周。在植入后4周和植入后8周，在rASCs-Gel (Ctrl)和rASCs-TenoGel (tECM+Loading)中仍然可以检测到DiR阳性信号，表明移植细胞的持续保留和活力（图6B）。这些发现表明GelMA/OA水凝胶能够支持rASC在体内的长期保留和活力。
rASCs-TenoGel（tECM+Loading）组的长度和横截面 (CSA)与完整对照肌腱相当，而其他受伤组肌腱长度更长、CSA更大（图6C）。此外，由于恢复机械性能对于肌腱的正常功能至关重要，因此在植入后8周对再生肌腱进行了拉伸测试。失效模式分析显示，完整对照肌腱主要在髌腱-胫骨连接处发生断裂。类似地，rASCs-TenoGel (tECM+Loading) 组在髌腱-胫骨连接处表现出40%的断裂率，而所有其他受伤组在髌腱-胫骨连接处都表现出强烈的断裂趋势 (100%)（图6D）。总的来说，实验结果表明，rASCs-TenoGel（tECM+Loading）组有效恢复了受伤肌腱的拉伸性能，这是肌腱功能恢复的重要指标。
图6 优化的TenoGel与rASC联合用于大鼠肌腱缺损模型肌腱修复的表征
在植入后4周和8周，对不同组的肌腱愈合情况进行了组织学比较。苏木精和伊红(H&E)染色和细胞排列的半定量分析显示，rASCs-TenoGel (tECM+Loading)表现出梭形细胞和排列整齐的波浪形ECM结构，而仅缺损组、仅凝胶组和rASCs-Gel (Ctrl)组表现出圆形细胞和混乱的ECM结构（图7A）。此外，用偏光显微镜检查苦味红(PSR)染色以及相关的半定量分析显示，与仅缺损组和仅凝胶组相比，rASC 治疗组（即rASCs-Gel (Ctrl) 和 rASCs-TenoGel (tECM+Loading)）的双折射增加且胶原纤维（红橙色）更厚（图7A）。阿尔新蓝染色及其相关的半定量分析以及番红花O染色表明，所有损伤组在4周时均有硫酸化糖胺聚糖 (sGAG) 的积累（图7A）。植入后8周，rASC-TenoGel (tECM+Loading)组显示出与完整对照组相似的组织学特征（图7B）。结果表明，rASCs-TenoGel(tECM+Loading) 组增强了肌腱修复，波浪状、对齐的胶原结构的恢复和异位骨化的消失证明了这一点。
图7 对预处理 rASCs-TenoGel用于大鼠髌腱缺损模型中肌腱修复的组织学评估
综上，本研究提出了一种新颖的材料组学方法来指导TenoGel的设计，用于干细胞介导的肌腱修复——这是肌腱研究领域的一个重大进步。与传统的经验优化不同，材料组学策略使用转录组数据驱动的方法系统地探索了TenoGel生态位特征和肌腱发生分化之间的复杂相互作用。材料组学指导的TenoGel设计见解与体内肌腱愈合结果之间的这种强相关性也凸显了这种数据驱动策略在生物材料工程解决方案中的潜力。
文章来源：
https://doi.org/10.1002/adma.202313722
