微凝胶（MG）增强水凝胶，也被称为葡萄干布丁凝胶或MG-水凝胶复合材料，是一种可以将MG物理捕获到大体积水凝胶基质中的双网络系统，表现出MG和水凝胶的协同效应，并减少单独使用的局限性。大体积水凝胶网络为MG提供一个扩散屏障，并增强凝胶基质的生物相容性。豌豆蛋白分离物（PPI）是一种新出现的非过敏性植物蛋白，由于其必需氨基酸的组成和胶凝特性，可以取代过敏性或动物源蛋白。果胶广泛存在于植物细胞壁的中间层，如蔬菜和水果。低甲氧基果胶（LMP）代表低酯化程度（< 50%）的果胶，在钙等二价离子的存在下形成凝胶。在此背景下，韩国庆熙大学Yoon Hyuk Chang及其团队制备了MG增强的共生低甲氧基果胶（LMP），填充不同浓度（0%、0.2%和0.4%）的果胶低聚糖（POS）水凝胶珠作为罗伊氏乳杆菌（L. reuteri）的输送系统。SEM结果显示，将POS加入水凝胶珠中，使凝胶基质更光滑、致密，减少益生菌泄漏，提高包封效率。FT-IR分析观察到LMP和钙离子之间有新的离子交联。体外消化结果表明MG增强的共生水凝胶珠在整个上消化道的存活率高于MG，其中含0.4%POS的水凝胶珠存活率最高。在模拟结肠的条件下暴露48小时后，大部分L. reuteri从所开发的系统中释放出来。MG增强的共生水凝胶珠比单独的MG具有更高的热稳定性和储存稳定性，表明在MG中添加水凝胶珠层可以有效地保护L. reuteri免受环境压力。
相关研究内容以“Structural, physicochemical, and in vitro digestion properties of microgel-reinforced synbiotic hydrogel beads filled with pectic oligosaccharides as a delivery system for Limosilactobacillus reuteri”为题于2024年10月23日发表在《Food Chemistry》上。
图1 柑橘皮果胶和POS的分子量（Mw）分布
一些研究人员将Mw为0.3-5kDa的果胶衍生分子归为POS。在此基础上，本研究进行Mw分布分析，以确定制备的柑橘皮果胶水解物是否可以被考虑为POS。如图1所示，柑橘皮果胶的Mw约为405.44 kDa，而POS的Mw约为1.51 kDa。有研究利用内聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶的联合酶解，从商业柑橘果胶中生产出Mw小于3.5 kDa的POS。因此，果胶XXL的酶解作用适合于从Mw相对较低的柑橘皮果胶中生产POS。
图2 MG和填充不同浓度POS的共生水凝胶珠的扫描电镜（SEM）图像
MG及MG增强的共生水凝胶珠的SEM图像如图2所示。整个样品表面均未观察到益生菌，说明成功封装L. reuteri。MG显示出一个不规则、有多个孔隙的表面。MG增强的共生水凝胶珠表面粗糙，并有一些孔隙。此外，随着POS浓度增加，水凝胶珠的表面更平滑，孔隙更小。本研究观察到，MG被成功加入到水凝胶珠中，POS的掺入使基质更光滑，孔径变小，并填充了水凝胶珠的内部结构。
图3 PPI、MG、POS、LMP和MG增强的共生水凝胶珠的X射线衍射（XRD）图谱和傅里叶变换红外（FT-IR）光谱
PPI、MG、POS、LMP和MG增强共生水凝胶珠的XRD模式如图3A所示。PPI的XRD图在9°和19°处的2θ衍射角出现尖峰，这是由于其多肽链结构中分别存在α-helix和β-sheet。与PPI相比，MG的峰更宽，但在13°和19°时仍有尖峰。POS多表现为非晶态结构，在18°处有一个宽峰。LMP在14°和21°处呈现2θ衍射角，表现为半晶态结构。所有MG增强的共生水凝胶珠均呈无定形结构，无峰。因此，本研究证明MG成功加入MG增强的共生水凝胶珠，水凝胶珠能够降低结晶度，形成无定形结构。PPI、MG、POS、LMP和MG增强的共生水凝胶珠的FT-IR光谱如图3B所示。PPI的主要特征峰分别出现在3272、2927、1633和1520cm-1处，分别为O-H拉伸、C-H拉伸、酰胺I（C=O拉伸）和酰胺II（C-N和N-H拉伸）。MG样本在3276（O-H拉伸）、2925（C-H拉伸）、2854、1744和1629cm-1处发现特征峰。在LMP的FT-IR光谱中，主要的特征峰分别出现在3287、2931、1728、1600、1408、1141和1071cm-1处。POS分别在3254、2929、1729、1595、1410、1143和1016cm-1处出现特征峰。与Ca2+离子交联后，LMP在1408和1600cm-1处的羧基峰转向更高的波数（分别为1440和1625cm-1）。FT-IR结果证实，本研究中产生的MG是通过使用TGase和钙离子的酶促和离子交联形成的。此外，在MG增强的共生水凝胶珠中，分子间和分子内的相互作用不仅通过LMP和钙离子的离子交联，而且通过水凝胶珠中加入POS产生的氢键，导致MG增强的共生水凝胶珠的形成。
图4 在模拟口腔、胃和肠道条件下，MG和MG增强的共生水凝胶珠包裹的罗伊氏乳杆菌的存活率（%）
MG和MG增强的共生水凝胶珠暴露于模拟口腔、胃和肠道条件后的存活率如图4A所示。结果显示，MG额外的水凝胶层、将POS加入水凝胶中可以在恶劣条件（低pH、胆盐）下有效保护上消化道的L. reuteri，将益生菌安全地传递到结肠。在模拟结肠条件下，MG和MG增强的共生水凝胶珠暴露48 h后的释放速率如图4B所示。结果表明，通过交联LMP和钙离子产生的额外层可以延迟模拟结肠流体向凝胶基质的渗透，以活性形式向结肠传递更多的益生菌。
图5 L. reuteri在MG和MG增强的共生水凝胶珠中的热稳定性
在不同热处理条件下（63°C 30 min和72°C 15 s），评价游离细胞和封装细胞在MG和MG增强的共生水凝胶珠中的活力，结果如图5所示。两种热处理后，游离细胞的活力均明显降低。在63°C 30 min和72°C15 s热处理后，L. reuteri在所有MG增强的共生水凝胶珠中的活力均显著高于MG。因此，从两种热处理中获得的结果表明，在MG中添加一层增强水凝胶珠可以有效保护益生菌免受热应激的影响。
图6 L. reuteri包裹在MG和填充不同浓度POS的共生水凝胶珠中的储存稳定性
游离细胞和包封细胞在MG和MG增强的共生水凝胶珠中在4°C下储存14天的稳定性结果如图6所示。游离细胞在保存7、14天后均减少。而用MG和MG增强的共生水凝胶珠包裹的L. reuteri的活力高于游离细胞。此外，MG增强的共生水凝胶珠在整个过程中表现出比MG更高的存储稳定性。特别是在储存7天之前，MG增强的共生水凝胶珠中的L. reuteri活力没有显著下降。因此，在本研究中，MG增强的共生水凝胶珠相对于MG具有更高的保护作用，可能是由于LMP/Ca2+水凝胶网络提供额外的屏障功能。有趣的是，在水凝胶珠中加入POS显著提高水凝胶珠中L. reuteri的储存稳定性，表明MG增强的共生水凝胶珠可以作为基质来包裹并保护L. reuteri免受外部环境的影响。
全文小结
综上，本研究制备不同浓度POS的MG增强合成生物水凝胶珠作为L. reuteri的传递系统。XRD结果表明，MG成功加入到共生水凝胶珠中。如SEM分析所示，在水凝胶珠中加入POS可以使凝胶基质更平滑，内部结构更紧凑。通过FT-IR分析，观察到共生水凝胶珠中LMP离子与钙离子与氢键之间形成离子交联。随着POS浓度增加，L. reuteri在MG增强的共生水凝胶珠中的包封效率提高。在模拟的口腔、胃和肠道条件下，MG增强的共生水凝胶珠的存活率高于MG，特别是MG/LMP/POS0.4的存活率最高。在模拟结肠条件下孵育后，MG增强的水凝胶珠可以释放大部分益生菌。MG增强的共生水凝胶珠比MG具有更高的热稳定性和储存稳定性。总之，MG增强的共生水凝胶珠可作为L. reuteri的结肠靶向传递系统，并提高其稳定性。此外，MG/LMP/POS0.4可以作为制造共生生物封装基质以提高益生菌细胞活力的合适候选材料。
文章来源：
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2024.141764
