霍乱弧菌是霍乱的病原体，霍乱是一种严重、甚至是致命的腹泻病。据估计，霍乱弧菌每年造成300-500万例霍乱病例，造成10-12万人死亡。目前，口服补液溶液是治疗霍乱最重要、有效的方法。然而，这种治疗策略并不影响细菌的存活或毒性，其有效性有限，特别是在年幼和老年患者中。全面了解毒性是如何被调节的，从而开发毒性抑制剂是一种有效的策略。在此，南开大学刘斌等通过野生型和突变型细菌的竞争性感染表明，壳聚糖利用调节因子ChsR会增加霍乱弧菌的体内毒力；而壳寡糖（COS）通过特异性破坏ChsR介导的途径，有效抑制霍乱弧菌的毒力。从在机制上讲，RNA测序、染色质免疫沉淀测序和分子生物学方法显示，ChsR直接上调促进霍乱毒素和毒素共同调节菌毛的表达的毒力调节因子TcpP的表达，以响应小肠中的低O2水平。壳聚糖降解产物抑制ChsR-TcpP启动子的相互作用。同样，壳聚糖，特别是通过海藻酸钠微球载体时，通过阻断ChsR介导的途径减少小鼠霍乱弧菌肠道定植并减轻疾病严重程度。本研究揭示了COS作为霍乱防治的补充治疗潜力。
相关研究成果以“Vibrio cholerae virulence is blocked by chitosan oligosaccharide-mediated inhibition of ChsR activity”为题于2024年10月16日发表在《Nature Microbiology》。
图1 LacI型调节因子ChsR增强霍乱弧菌毒力
初生小鼠竞争性感染试验显示，与野生型（WT）相比，ΔchsR在小肠中表现出明显的肠道定植能力缺陷，而ΔchsR+在小肠中与WT均匀竞争（图1a）。接着评估霍乱弧菌在初生小鼠小肠中产生的霍乱毒素（CTX）。结果显示，WT或ΔchsR+在小鼠小肠中产生的CTX量明显高于ΔchsR感染的小鼠（图1b-e），表明chsR的缺失抑制CTX产生。进一步研究霍乱弧菌对初生小鼠小肠造成的组织学损伤，发现WT感染小鼠的组织病理学评分远高于ΔchsR感染小鼠（图1f、g），说明与野生型感染引起的疾病相比，小鼠ΔchsR感染引起的疾病严重程度降低。综上数据表明chsR有助于细菌肠道定植和CTX的产生，导致宿主体内疾病强度的增强。
图2 ChsR通过调节毒力基因的表达增强霍乱弧菌的致病性
本文首先研究ChsR对霍乱弧菌致病性的影响是否与其调控chsABC的表达有关。通过分析ΔchsB或ΔchsR在添加0.5%（GlcN）2的M9最低培养基中的生长情况，证实了ChsB和ChsR参与细菌对（GlcN）2的摄取（图2a）。竞争性感染试验显示，ΔchsB在小鼠小肠中与WT的竞争相似（图2b）。qRT-PCR检测证实，与体内WT相比，ΔchsR中毒力基因tcpP、toxT、ctxA和tcpA在体内的表达降低（图2c、d）。免疫印迹分析显示，与WT相比，ΔchsR中CTX的产量显著减少（图2e、f）。以上结果表明，chsR增强毒力因子的表达，从而促进霍乱弧菌在体内的致病性。
图3 ChsR直接激活tcpP的表达，导致下游毒力基因的表达增加
通过染色质免疫共沉淀和测序（ChIP-seq）分析，在霍乱弧菌基因组上检测到49个ChsR的潜在结合位点，其中包括tcpP启动子区域的一个位点，这是霍乱弧菌的主要毒力调节因子之一（图3a）。ChIP与定量PCR（ChIP-qPCR）检测结果显示，与对照DNA相比，tcpP和chsB启动子均通过结合显著富集ChsR（图3b），说明ChsR直接调控tcpP和chsB的表达。竞争性电泳迁移率测定（EMSAs）显示，ChsR以特异性的方式与荧光素酰胺（FAM）标记的PtcpP或PchsB结合。添加未标记的PtcpP或PchsB可以有效地竞争ChsR与标记的PtcpP或PchsB的结合（图3c-e）。这些结果表明，ChsR可以特异性地结合到tcpP和chsB的启动子区域。利用基于染料的DNase I足迹分析，在tcpP的启动子区域发现一个特定的chsR结合序列，其中包含一个34个碱基对序列（图3f）。在相同条件下，使用PtcpP-mutantDNA片段（没有34 bp的结合位点）进行竞争性的EMSAs检测，结果显示，34 bp结合位点的缺失完全消了ChsR与PtcpP的结合（图3g）。还通过竞争性EMSAs研究ChsR与标记的PtcpP和未标记的PtcpP-mutant的结合。结果显示，未标记的PtcpP-mutant并没有导致迁移条带的减少，表明ChsR不能与PtcpP-mutant结合（图3h）。这些数据表明ChsR通过与启动子区域结合直接调控tcpP的表达。接下来研究ChsR是否通过TcpP调控霍乱弧菌毒力基因的表达，并构建ΔtcpP突变体和ΔtcpPΔchsR双突变体。qRT-PCR检测显示，toxT、tcpA和ctxA等毒力基因的表达显著降低（图3i）。然而，在ΔtcpP背景下，chsR的缺失对毒力基因的表达和细菌肠道定植能力没有影响（图3i、j），说明chsR对毒力基因表达的调控作用是由TcpP介导的。综上数据表明ChsR能够通过直接结合其启动子区域来增强tcpP的表达，从而导致下游毒力基因的表达增加。
图4 （GlcN）2和GlcN通过抑制ChsR与tcpP启动子区域的相互作用，降低霍乱弧菌毒力基因的表达
EMSAs结果显示，ChsR与tcpP和chsB启动子的结合受到（GlcN）2和GlcN的抑制（图4a、b）。表面等离子体共振（SPR）实验显示，（GlcN）2和GlcN能够与纯化的ChsR蛋白相互作用（图4c）。对接结果显示，（GlcN）2与GlcN通过氢键、范德华相互作用和pi-pi相互作用与ChsR结合，两者之间存在稳定的相互作用（图4d）。COS的结构与壳聚糖相似。通过在添加0.5%COS的M9培养基中培养细菌，发现（GlcN）2、GlcN或COS孵育显著降低WT株毒力基因的表达（图4e）。而用（GlcN）2、GlcN或COS处理ΔchsR、ΔchsR+（R194Q）或ΔchsR+（R194A）菌株对细菌的毒力基因表达没有影响（图4f-h）。综上所述，（GlcN）2、GlcN和COS可以通过抑制ChsR的功能降低霍乱弧菌中毒力基因的表达。
图5 COS具有作为一种霍乱治疗和预防候选药物的潜力
接下来研究COS是否可以在用四种抗生素混合物处理的成年小鼠模型中降低体内的霍乱弧菌毒力（图5a）。qRT-PCR检测结果显示，与未接受COS的小鼠相比，摄入浓度为0.5%的COSWT小鼠（而非ΔchsR、ΔchsR+（R194Q）或ΔchsR+（R194A））的毒力基因表达显著降低（图5b、c）。在进行细菌口服时给予0.5-2%COS的小鼠小肠中的定植量明显低于未接受COS的小鼠（图5d）。与未接受COS的小鼠相比，给予COS的WT小鼠（而不是ΔchsR）造成的组织学损伤减少（图5e、f）。综上，通过抑制ChsR的功能，小肠中COS的存在导致霍乱弧菌的体内毒力降低，进而降低宿主体内的疾病强度。此外，还研究了COS预防霍乱弧菌感染的潜力（图5g）。
图6 CNMs是治疗霍乱弧菌感染的有效药物
为提高COS治疗和预防霍乱的效果，本研究设计了含有COS纳米颗粒的SA微球。COS纳米微球（CNM）的制备示意图如图6a所示。图6b-e显示了亮场显微镜、扫描电子显微镜（SEM）和荧光显微镜下的CNMs形貌。考虑到口服给药的可行性，选择300-500μm的微球进行后续实验（图6f）。进一步研究CNM在胃肠道中的稳定性和释放情况。磷酸盐缓冲液（PBS）和模拟胃液（SGF）的荧光强度比值没有显著变化，而模拟肠液（SIF）的荧光强度比值显著增加，21 h后接近100%（图6g-j），表明SA保护COS在SGF中的降解，并延长其在SIF中的保留时间。通过体内成像系统（IVIS）观察口服给药后CNMs的分布。给药6h后在小肠中可检测到CNMs，24h后在回肠和结肠中完全消除（图6k、l），表明微球体有效保护COS不受胃液损伤，并可在肠道中积累。与COS相比，CNMs在治疗和预防霍乱方面有更还的效果（图6m、n）。各组间体内细菌附着效率无显著性差异，说明COS和CNMs对霍乱弧菌的存活率均无影响（图6o）。以上数据表明COS和CNMs的浓度并不影响霍乱弧菌的存活，且COS或CNMs对霍乱弧菌感染的治疗作用是由于它们对ChsR功能的影响，而不是其抗菌作用。
全文小结
综上所述，本研究以SA微球作为载体，采用气流剪切法将COS靶向递送到小肠，从而提高治疗效果。本研究发现低O2信号可以在宿主小肠中诱导chsR表达，促进该感染部位CTX和TCP的产生，从而增强细菌在宿主体内的致病性。COS可以特异性抑制chsR介导的霍乱弧菌毒力调节途径，从而在动物模型中显著降低细菌肠道定植和疾病严重程度。COS具有应用广泛、成本低、管理方便、储运方便等优点。因此，COS有可能作为口服补液进行霍乱补充治疗，并作为霍乱弧菌感染的预防药物。此外，与直接口服COS相比，CNMs可以防止COS在胃环境中的降解，并在肠道中实现缓释，有效提高COS的生物利用度。
文章来源：
https://doi.org/10.1038/s41564-024-01823-6
