众所周知，细胞可以通过全细胞运动（例如扩散、迁移或体积膨胀）在三维空间（e.g. Hydrogel）微环境发生物理相互作用时，细胞可以通过全细胞运动主动推拉细胞外基质(ECM)。这些行为会持续数小时至数天，影响长期细胞命运。
先前的研究说明了快速亚细胞动力学，例如细胞骨架和粘着斑的变化，发生在秒级。然而，对3D环境中的全细胞运动（例如细胞扩散、迁移和体积膨胀）的研究集中在更长的时间尺度上，从几小时到几天不等。目前尚不清楚三维全细胞运动是否可以在更快的时间尺度上发生，以及这种快速细胞运动如何影响长期细胞命运（如分化）。在先前的研究中，来自美国斯坦福大学的Fan Yang（杨帆）团队使用基于聚乙二醇(PEG)的滑动水凝胶(SG)作为3D微环境，证明细胞重组其局部ECM的能力可增强MSC分化为多个谱系（Adv. Mater., 2016, 28, 7257-7263.）。然而，驱动增强分化的细胞行为和相关机制仍然很大程度上未知。
（Adv. Mater., 2016, 28: 7257-7263.）
对此问题，该团队在8年后给出了答案并发表在《Nature Materials》上。本文报告了一种前所未有的细胞行为——“细胞翻滚”，其特征是分钟级的全细胞运动和快速的水凝胶变形，由秒到分钟级的细胞骨架和核动力学增强引起。已有研究证明MSC和软骨细胞会在水凝胶中在数小时到数天内发生体积膨胀，从而在数周内诱导增强的MSC成骨作用和软骨细胞的软骨沉积。因此，本文作者重点研究了MSC软骨形成，表明抑制或促进MSC的细胞翻滚会调节向软骨细胞的分化。此外，它与抑制整体染色质状态有关，这对于增强软骨形成必不可少。最后，作者证明细胞翻滚发生在向其他谱系分化的过程中，其分化增强效果已在各种水凝胶平台中得到验证。
相关研究成果以“Cell tumbling enhances stem cell differentiation in hydrogels via nuclear mechanotransduction”为题于2024年11月1日发表在《Nature Materials》上。
1.增强的MSC软骨形成与细胞翻滚有关
为了研究局部ECM的可重组性如何调节MSC分化，该团队首先使用基于PEG的SG系统评估MSC软骨形成，该系统促进了微环境的物理重组。图1a为滑动水凝胶（SG）和化学水凝胶（CG）的示意图，展示了SG具有可移动的交联点和配体，而CG则具有固定的交联点和配体。这一设计使得SG中的细胞可以通过推拉力重新组织局部水凝胶网络，促进细胞翻滚。图1b展示了MSC在SG和CG中经过21天软骨诱导后的Safranin O染色，用于显示硫酸软骨素的沉积。图中SG顶部的图片显示了更多的红色染色区域，表明在SG中软骨基质沉积显著增多。SG和CG通过动态光散射基微流变技术测得的储存模量和损失模量，显示了水凝胶的局部机械性能（图1c左）。图1c右侧则是通过平板剪切流变仪测得的宏观机械性能。结果表明SG在细胞相关的时间尺度上显示出更为柔软的响应，这可能有助于细胞重新组织局部矩阵并促进细胞翻滚。
图1 增强的MSC软骨形成与三维空间中分钟级的细胞翻滚有关
图1d和图1e展示了SG和CG中单个活细胞的时间延迟图像序列，显示SG中的细胞表现出高度动态的翻滚行为，而CG中的细胞则相对静止。作者还展示了同一细胞在SG和CG中随时间变化的轮廓叠加图，彩色编码显示了细胞形态的变化（图1f）。作者在图1g和图1h中分别显示了细胞形状相关性系数、细胞中心速度和主轴的角速度的量化分析，证实了SG中的细胞翻滚速度和角速度显著高于CG。视频1则生动的展示了SG和CG的细胞翻滚行为。这些图像和数据共同证明了SG的设计能够有效促进MSC的细胞翻滚行为，并通过细胞核力学传导机制增强MSC向软骨细胞的分化。
2.翻滚与增强的亚细胞动力学有关
接着，作者在此部分进一步揭示了细胞翻滚与细胞亚结构动态增强之间的关联。首先，图2a展示了通过追踪SG和CG中嵌入荧光微珠的位移，量化了15分钟内细胞周围基质的最大形变。左侧的热图显示了SG顶部的微珠位移，相比之下，CG底部的位移显著较小。这一结果表明，SG中的细胞翻滚伴随着更显著的周围基质形变。图2b至图2f展示了SG和CG中的细胞肌动蛋白（F-actin）动态。图2b左侧的图像展示了SG顶部和CG底部的F-actin标记细胞。中间的彩色叠加图揭示了在5分钟实时成像期间，皮层F-actin在皮层的存在位置，右侧的量化分析则显示了实时成像期间皮层actin的动态。这些结果证实，在SG中，细胞的F-actin动态显著增强，表明细胞骨架在细胞翻滚中起到了关键作用。图2h和图2i分别为细胞核移动的轨迹和移动速度的量化分析，结果显示SG中的细胞核移动速度显著高于CG，这些发现支持了细胞核动力学在调节细胞翻滚中的作用。通过速度和方向的关联分析进一步揭示了细胞和细胞核在翻滚中的协调运动，这些分析显示了细胞和核之间在翻滚过程中速度和移动方向的高度一致性（图2j-k）。总的来说，这些数据强调了细胞翻滚如何与细胞亚结构动态相关联，并指出了细胞核在其中的关键作用，揭示了细胞翻滚行为在细胞分化中可能的调节机制。
图2 细胞翻滚与MSCs中秒至分钟级细胞骨架和核动力学增强有关
3.翻滚驱动机制增强MSC软骨形成
接下来，作者检查了在21天的培养期内细胞翻滚持续的时间。在SG中分化的第0天（封装时）、第2天和第4天进行了分钟级活细胞成像。到第4天，SG中的MSC翻滚已显着降低至与CG中的细胞相当的水平（图3a）。细胞翻滚的减少伴随着亚细胞动力学的降低，包括细胞周围基质变形（图3b、c）、F-肌动蛋白和皮质肌动蛋白动力学（图3d）以及核运动速度（图3e）。这表明细胞翻滚在MSC软骨形成的前3-4天内最为明显，表明早期动力学在调节软骨形成中可能发挥关键作用。
为了确定是否存在SG增强软骨形成所需的细胞翻滚关键时间窗口，用blebbistatin处理SG中的MSCs，以抑制21天培养期间不同时间的细胞翻滚（图3f）。这种处理在不同时间窗口进行，以评估抑制细胞翻滚对软骨形成的影响。最后展示了在SG和CG中，不同blebbistatin处理日对软骨特异性基质沉积的影响。使用Safranin O染色的冷冻切片样本结果显示，早期抑制细胞翻滚显著降低了SG中的软骨形成，而在CG中抑制细胞翻滚对软骨形成的影响较小。综上，通过多种生物物理参数的量化分析，作者强调了细胞翻滚行为在MSC向软骨细胞分化过程中的调节作用，并揭示了这一行为在分化早期的重要性。
图3 早期细胞翻滚对于增强MSC的三维软骨形成至关重要
4.翻滚与染色质状态受抑制有关
越来越多的证据表明，细胞核和染色质对外力具有高度的机械敏感性。鉴于细胞翻滚过程中细胞核的动态性明显更强，作者假设这种行为会改变细胞核的机械感应和染色质状态，从而调节SG中的软骨形成。首先，通过Western blot展示了在SG和CG中细胞翻滚24小时后的核机械负荷标志物（如Lamin A/C）和染色质可访问性标志物（如H3K9me3和H3K27me3）的表达量（图4a-b）。结果显示，在SG中这些标志物的表达显著增加，表明细胞核在翻滚过程中受到更强的机械负荷，同时染色质状态更加封闭。图4c-d提供了免疫荧光染色图像和核信号强度沿核边界距离的定量分析，用以描绘不同标记在SG和CG中的核定位变化，进一步验证了在SG中细胞核负荷和染色质抑制状态的增加。
利用转座酶可及性染色质测序(ATAC-seq)分析，探讨了SG和CG中染色质区域可访问性的差异（图4e-g）。主成分分析（PCA）和火山图表明，在SG中相较于CG，大量的基因区域显示出可访问性的降低，表明细胞翻滚与全局染色质封闭状态相关联。图4h展示了不同染色质抑制剂（如chaetocin抑制H3K9me3，GSK343抑制H3K27me3）在21天的软骨分化诱导期间的处理效果。通过Safranin O染色的冷冻切片样本结果显示，这些处理显著降低了SG中的软骨形成，进一步证明了早期染色质状态的抑制对于细胞翻滚促进的软骨细胞分化至关重要。
图4 细胞翻滚与抑制的整体染色质状态有关，而这种状态是增强MSC在三维空间中的软骨形成所必需的
5.翻滚可通过PLA2信号传导调节MSC软骨形成
鉴于细胞骨架-细胞核耦合对于细胞翻滚和增强软骨形成至关重要，该团队进一步探讨了细胞核机械传感在这种行为中的作用。示意图展示了细胞核伸展如何触发PLA2活化的机制，这一过程通过增强肌动蛋白收缩性来促进细胞迁移和翻滚，是核力学传感的关键环节（图5a）。使用H2B-eGFP标记的核在SG和CG中的形变情况展示在图5b-5c中，通过时间序列图像捕捉了在SG中的显著核形变。图5c的量化数据显示，SG中的细胞核形变幅度显著高于CG，表明SG环境促进了细胞核的动态形变。WB显示，在SG中PLA2及其磷酸化形式（p-PLA2）的表达水平显著高于CG（图5d）；进一步通过药物干预实验（使用PLA2抑制剂和花生四烯酸（ARA）处理）证明了PLA2信号对细胞翻滚速度和核动力学的调节作用（图5e-f）。
接着，结合使用Safranin O染色的冷冻切片样本，量化了PLA2信号通路激活对MSC软骨分化的具体影响（图5g-h）。在抑制PLA2信号通路的条件下，SG中的软骨形成显著减少，而ARA的补充能显著增强SG中的软骨分化，这证明了PLA2信号通路在细胞翻滚调控MSC向软骨细胞分化中的关键作用。通过一系列生化实验和细胞学分析揭示了细胞翻滚通过PLA2信号通路对MSC的软骨分化能力的调控机制，进一步阐明了细胞物理环境对细胞分化命运的深远影响。
图5 细胞翻滚与增强的核拉伸和PLA2信号传导有关，可以通过调节这些信号来增强MSC软骨形成
6.细胞翻滚发生在三维空间中的各种场景中
最后，作者详细探讨了细胞翻滚在多种三维环境中的出现以及它如何影响多种细胞系的分化能力。图6a至图6d展示了细胞翻滚在不同类型的三维水凝胶中对间充质干细胞（MSC）向骨细胞和脂肪细胞分化的影响。通过Alizarin Red S染色和Oil Red O染色显示，SG（滑动水凝胶）中的细胞比CG（化学水凝胶）展现出更高的矿物质沉积和脂肪滴形成，这表明细胞翻滚在促进这些分化路径中发挥了作用。量化数据显示，SG中的细胞在骨性和脂肪性诱导早期显示出更高的翻滚速度和角速度（图6b-d）。随后，探讨了在可降解和粘弹性水凝胶中细胞翻滚的表现及其对软骨细胞分化的影响。这些图示和相应的Safranin O染色结果显示，在这些特殊类型的水凝胶中，细胞翻滚也显著促进了软骨基质的沉积。图6i提供了一个总结性的图示，概述了细胞翻滚和相关的分子机制如何在三维矩阵中通过物理限制和允许局部矩阵重组来发挥作用。此图还描绘了细胞骨架收缩力、Ezrin蛋白、LINC复合体、PLA2-ARA信号通路和染色质凝结等分子事件是如何与细胞翻滚相关联，并进一步调控MSC的分化。
图6 细胞翻滚与三维中向其他谱系的增强分化有关，并且发生在各种水凝胶平台中
综上，本文有助于更好地理解细胞与三维基质相互作用的复杂性及其对细胞命运的影响，同时为再生医学和组织工程领域提供了新的见解和方法。具体表现在：
（1）细胞翻滚与分化能力增强的关联：细胞翻滚能显著促进间充质干细胞（MSC）向软骨细胞的分化，这种影响通过细胞核力学传导机制实现，与全局染色质状态的变化有关。对于软骨相关的研究学者来说，可能会是材料影响软骨分化的又一个研究热点？！
（2）三维环境的影响：细胞翻滚不仅在滑动水凝胶（SG）中观察到，还在多种三维水凝胶环境中发生，包括可降解和粘弹性水凝胶，这表明细胞翻滚是一种普遍的细胞行为，能在不同的物理环境中调节细胞的生物学功能。
（3）细胞翻滚的广泛影响：该团队的研究结果强调了细胞翻滚作为一种调节干细胞分化的物理机制的潜在重要性，为利用细胞力学影响干细胞命运提供了可能的新策略。
文章来源：
https://doi.org/10.1038/s41563-024-02038-0
