什么是Primer article？
Nature Reviews Methods Primers期刊将Primer定义为“泛读本，提供全面、权威的方法或技术综述”。该期刊将Primers归为介绍性的综述文章（introductory review article），它的本质仍然是综述。Primers内容更加宽泛，面向处于不同学习阶段的跨学科研究人员，非常适合泛读。
什么是荧光寿命成像显微镜？
荧光寿命成像显微镜（FLIM）是一种利用荧光染料生成逐像素荧光寿命空间图的显微技术，被广泛应用于观察细胞、组织甚至整个生物体内的不同结构、目标和动态过程。当分子中的电子被吸收的光激发到更高的能级，随后返回到基态，以光的形式释放能量时，就会发生荧光。荧光寿命（称为τ）是荧光团返回基态所需的平均时间，FLIM将寿命测量与成像相结合，提供关于荧光分子空间分布和生化状态的信息。
近期，美国加州大学欧文分校Michelle A. Digman/Belen Torrado联合乌拉圭共和国大学Leonel Malacrida团队提供了FLIM的全面概述，详细介绍了它的原理，最近的进展和各种应用（方案1）。希望本篇Prime能够激发生物成像研究人员充分了解FLIM，推进对复杂生物系统的理解。相关研究成果以“Fluorescence lifetime imaging microscopy”为题于2024年11月7日发表在《Nature Reviews Methods Primers》上。
方案1 PrimeView1（期刊编辑部根据文章内容制作）
首先，作者对FLIM的基本概念进行了概述。FLIM实验的步骤包括样品制备、成像、数据转换和分析（图1）。FLIM可以在激光扫描共聚焦显微镜或多光子显微镜中进行。随后，作者列举了使用时间标记和相位调制偏移方法时所需的关键设备组件，如脉冲激光源、单光子探测器和数据采集系统。表1总结了FLIM不同的成像方式，包括它们的优点和缺点，以及最适合每种成像方式的实验类型。
图1荧光寿命成像显微镜基本概念概述
表1 荧光寿命成像显微镜的各种成像方式
随后，作者介绍了使用phasor方法分析荧光寿命的过程。图2主要展示了如何通过将荧光衰减数据表示为复平面中的点，来进行荧光寿命的定量分析。具体来说，使用频率调制激发光和相位信息来得到一对坐标（G, S），这些坐标代表了每个像素的荧光衰减信息，可以在二维图中绘制，形成phasor图。
图2 用phasor法分析荧光寿命
随后，作者介绍了FLIM在细胞和组织中的应用，特别是针对NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）的成像（图3）。NADH作为细胞内的一个重要代谢分子，其荧光寿命的变化反映了细胞内代谢过程和能量状态。通过FLIM技术，可以在细胞和组织中进行高分辨率的NADH成像，从而获得关于细胞代谢、能量利用以及其他生理过程的信息。值得注意的是，FLIM-NADH可以在活细胞中进行多重荧光成像，允许同时检测多个生物学靶标。这种多重成像能力对生物学研究和疾病诊断具有重要意义。
图3 细胞和组织中的FLIM-NADH
然后，作者介绍讨论了如何使用FLIM结合phasor分析方法进行荧光寿命测量的校准和应用（图4）。特别是，它强调了FLIM在重复性、稳定性和测量精度方面的优势。例如，FLIM可以在不同的实验设置和仪器中保持一致的荧光寿命测量，从而增强实验的可重复性。
图4 Phasor-FLIM的应用
最后，作者讨论了FLIM技术的局限性及其应对策略（图5）。
（1）死时间和脉冲堆积效应：FLIM技术面临的一个主要问题是探测器的死时间，这会导致探测器脉冲堆积效应。为了解决这一问题，现代单光子雪崩二极管（SPAD）和混合探测器（Hybrid Detectors）大大减少了死时间，从而缓解了这一问题。此外，软件修正也可用于补偿脉冲堆积效应，计算因这一效应导致丢失的概率。
（2）FLIM成像速度：FLIM的成像速度通常较慢，通常需要几秒钟才能积累足够的光子信号。为了加速FLIM成像，科学家们提出了一些新技术，包括并行化时间相关单光子计数（TCSPC）模块、多重激光器使用、宽场TCSPC、时间门控和脉冲采样技术等。这些技术旨在提高数据采集速度，并减少图像采集所需的时间。
（3）光子预算问题：在快速FLIM记录中，光子预算是一个重要的限制因素，因为较短的采集时间需要足够的光子信号来获得准确的结果。为了克服这一问题，提出了一种方法，即将到达单一探测器的光子脉冲分为四个并行的TCSPC模块，从而增加最大计数率，提高采集速度。
图5 荧光寿命成像显微镜的局限性和解决方法
综上，本文讨论了FLIM的原理、方法和分析，包括测量荧光寿命的不同方法，如时间标记和相位调制偏移方法，并介绍了这些方法的实现和设置变体。此外，文章还深入探讨了数据分析的不同途径，特别是phasor方法及其关键考虑因素。作者还展示了FLIM在各种应用中的广泛适用性，并讨论了技术的局限性和优化策略，如方法学的限制、设备的局限性和潜在的误差。总的来说，文章旨在弥补FLIM区域发展较慢的空白，提供FLIM技术的全面概述，并探讨未来的技术进展。
文章来源：
https://doi.org/10.1038/s43586-024-00358-8
参考文献：
https://doi.org/10.1038/s43586-024-00367-7
