由于缺血的微环境和机械性挑战条件，骨软骨组织的自我修复能力有限。基于细胞的组织工程是一种有前景的骨软骨再生策略，它受到诱导骨软骨形成的支架的影响，如生物活性剂和仿生微结构以及机械性能。当前的平台不尽如人意，因为它们未能在保留高孔隙率和生物活性的同时匹配天然骨软骨组织的机械强度。
来自清华大学的余家阔等团队开发了一种无需生长因子的多阶段多孔混合支架，由聚乳酸-共-乙醇酸（PLGA）骨架组成，具有毫微米两级孔隙和生物活性聚(γ-乙基-L-谷氨酸)（PELG）热响应水凝胶。使用低温沉积建模3D打印和盐析法，以氯化钠（NaCl）作为成孔剂，制备了具有可控孔结构和可调机械强度的高度多孔纯PLGA骨架。将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽和软骨生成分子卡托金（KGN）分别连接到聚乙二醇（PEG）和PELG的末端，以增强细胞增殖并诱导软骨分化。此外，多阶段PLGA/RGDPELGKGN多孔混合支架为外周血来源的间充质干细胞（PBMSCs）的增殖和软骨形成提供了有利环境，并成功修复了兔股骨滑车中的临界尺寸骨软骨缺损，表明其临床潜力用于骨软骨修复。相关工作以题为“Biomechanically matched and multistage hybrid porous scaffolds for stem cell-based osteochondral regeneration”的文章发表在2024年11月04日的期刊《Nano Today》。
1.创新型研究内容
本研究旨在结合强PLGA支架和生物活性温敏水凝胶的优势，以更好地模拟骨软骨组织的结构和功能。本文设计了一种具有多阶段孔隙结构、适当机械强度以及成骨诱导和成软骨诱导能力的骨软骨混合植入物（图1）。该设计基于一种三维打印的PLGA支架，并装饰有聚乙二醇2k-嵌段-聚(γ-乙基-L-谷氨酸)m (PEG2k-b-PELGm) 温敏水凝胶，如之前所描述。通过低温沉积建模（LDM）和盐浸法制备了具有可控孔隙结构和可调机械强度的PLGA支架。PEG2k-b-PELGm温凝胶经过粘附肽Arg-Gly-Asp (RGD) 的功能化处理，以增强细胞增殖能力，并通过添加小型成软骨分子卡托金（KGN）来提高其成软骨潜能。此外，本文还证明了在将装载PBMSC的混合支架植入兔股骨滑车骨软骨缺损处后，能够实现高质量的骨软骨修复。
图1 多阶段混合多孔支架示意图，载有外周血间充质干细胞（PBMSCs），用于修复兔的临界尺寸骨软骨缺损
【结合LDM制造和盐浸法以控制孔隙几何形状】
熔融沉积建模（FDM）或低温沉积建模（LDM）是常用的增材制造技术，用于精确制作具有原生组织模拟结构的聚己内酯（PCL）或PLGA基多孔支架。然而，PCL支架的较高机械强度（比原生骨软骨组织高）和缓慢降解阻碍了新组织的长入。此外，FDM加工过程中高温条件可能产生有毒成分并削弱PLGA支架的机械性能。因此，本文尝试使用LDM制备孔径为300微米的PLGA支架，据报道这种孔径适合细胞增殖和基质沉积在骨和软骨再生中。然而，所得到的PLGA支架表现出较差的几何控制和不一致的孔径结构（198.3 ± 116.8微米），这是因为相邻层和丝束的合并，如支架表面和横截面的扫描电子显微镜（SEM）图像所示（图2a）。
为了研究NaCl颗粒对各种PN支架的结构和机械性能的影响，本文测试了不同质量比的PLGA与NaCl（WPLGA:WNaCl = 2:1, 1:1, 1:2和1:3，分别称为PN21、PN11、PN12和PN13）在打印浆料中的配比。相较于纯PLGA支架（198.3 ± 116.8微米），PN21、PN11、PN12和PN13支架的平均孔径分别为293.3 ± 36.2微米、312.3 ± 26.7微米、302.8 ± 46.2微米和315.1 ± 24.9微米（图2b）。随着打印浆料中NaCl比例的增加，垂直接触区域的挤出丝束不太可能横向分散，避免了孔隙堵塞或变形。PN支架还具有显著粗糙的表面，这有助于细胞粘附。NaCl比例较高的PN支架表面更粗糙（图2a）。盐浸法处理后，NaCl占据的空间被释放出来，增加了PN支架的孔隙度。尽管宏观孔径相似，但盐浸法处理后的PN21（51.17% ± 1.12%）、PN11（59.88% ± 1.80%）、PN12（70.97% ± 0.83%）和PN13（74.91% ± 0.81%）的总体孔隙度显著高于PLGA（36.20% ± 5.12%）（P < 0.05）（图2c）。
图2 PLGA和PN支架的宏观/微观多孔特性和机械性能
【具有生物活性配体和持续KGN释放的功能化水凝胶】
双嵌段共聚物（mPEG2k-b-PELGm, PPG-K, R-PPG, 或 R-PPG-K）的水溶液在PBS中随着温度升高经历溶胶-凝胶相变，通过试管倒置法测定（图3a和b）。相变温度随着聚合物浓度的降低而增加。8重量百分比的mPEG2k-b-PELGm溶液的溶胶-凝胶转变温度为33℃，适用于体内应用。不同功能化水凝胶的溶胶-凝胶转变温度相似。通过动态机械分析获得了各种共聚物在8重量百分比PBS溶液中的存储模量G'和损耗模量G''随温度变化的情况（图3c）。在较低温度下，存储模量和损耗模量都相对较低，表现出典型的液体行为。然而，随着温度进一步升高，存储模量迅速增加，而损耗模量上升较慢，表明逐渐过渡到凝胶状态。当温度从10℃升至50℃时，这些多肽的G'呈现以下趋势：mPEG2k-b-PELGm (1210 Pa) > PPG-K (1152 Pa) > R-PPG-K (1032 Pa) > R-PPG (980 Pa)。添加的功能侧链基团（KGN或RGD）对PEG-多肽嵌段共聚物的凝胶行为没有显著影响。荧光法测定的R-PPG和R-PPG-K的RGD含量分别为4.24% ± 0.04%和4.25% ± 0.02%。R-PPG和R-PPG-K之间的RGD含量没有显著差异（P > 0.05，图S11a）。如图3d所示，R-PPG-K和PPG-K在体外显示出类似且持续的KGN释放，表明添加RGD对KGN的释放没有影响。释放的KGN浓度（116.96–458.269 nM）在产生软骨生成效应的有效范围内（中位有效浓度 = 100 nM）。
图3 功能化水凝胶的化学特性、生物相容性和软骨生成能力
【PBMSC负载的骨软骨结构在培养早期阶段的体外表征】
R-PPG-K的机械性能较差，仍然是在机械挑战性较大的关节内环境中应用的一个重大障碍。PN11/R-PPG-K混合支架结合了水凝胶和固体支架的优点，为PBMSCs创造了一个成软骨和保护性的微环境。在水凝胶降解后，单独的固体PN11框架可以用作3D多孔模板，以指导组织再生，并为体内再生组织提供足够的强度。PN11/R-PPG-K混合支架通过将PN11支架浸泡在R-PPG-K水凝胶溶液中并在37℃下孵育15分钟以启动凝胶化而制成（图4a）。扫描电子显微镜（SEM）显示，R-PPG-K凝胶均匀地掺入PN11支架的孔隙和表面（图4b-d）。R-PPG-K水凝胶的抗压强度为0.01 ± 0.01 MPa，与骨软骨组织的机械强度不兼容。与PN11支架复合后，混合支架的抗压强度达到8.18 ± 0.83 MPa，与单独支架的强度相似。因此，混合支架整合了R-PPG-K的成软骨诱导和细胞粘附能力以及PN11支架的整体机械强度，使其更适合用于骨软骨组织工程的构建。
图4 体外培养三周的PBMSC负载骨软骨构造物的形态观察、机械分析和生化分析
【在兔骨软骨缺损模型中，通过杂交支架增强骨软骨修复】
如图5a所示，12周后，空白组缺损中仅发现少量炎性肉芽组织，股骨滑车区域周围有中等程度的骨赘形成。相比之下，R-PPG-K和PN11组的缺损部分被新生组织修复，表面粗糙或有中度浅表缺损和沟槽，未见骨赘形成。杂交组则完全恢复，周边表面光滑，中央略有凹陷。磁共振成像（MRI）结果与宏观评估一致（图5b）。12周时，空白组的缺损被少量修复组织和液体信号填满。R-PPG-K或PN11处理的缺损被高信号或混合信号的修复组织填满。相比之下，杂交组则被略微不均匀的新组织表面填满，信号类似于健康组织。24周时，空白组的缺损区域主要为液体信号。与其他组相比，所有其他组的修复组织质量在12周基础上有所改善。R-PPG-K和PN11处理的缺损显示出软骨下骨的信号增加和粗糙的软骨表面。相比之下，杂交组的骨软骨缺损完全修复；组织与周围健康组织无法区分，且具有光滑的软骨表面。
图5 术后12周和24周，兔滑车骨软骨缺损再生的宏观视图、磁共振成像（MRI）观察和组织学染色
在扫描电子显微镜（SEM）观察中，R-PPG-K组显示出光滑的表面，但在修复组织与相邻软骨的交界处仍有间隙。相比之下，PN11组表现出不均匀的再生组织表面，有明显的台阶。杂交组的再生组织光滑，且与邻近的正常软骨紧密结合，与其他组相比有显著改善（图6a）。根据改良的Wakitani评分（图6b），本文进一步对骨软骨修复质量进行定量评估。空白组得分最低（12周为4.67 ± 2.05，24周为7.67 ± 2.42），而杂交组在12周和24周时得分最高（分别为17.33 ± 1.11和20.67 ± 0.94）。此外，水凝胶组和PN11组的修复组织质量随时间没有改善。12周后，水凝胶组的改良Wakitani评分高于PN11组，但在24周时两组之间没有显著差异（P > 0.05）。只有在杂交组中，24周时的评分有所增加，该组表现出最佳的透明软骨骨软骨修复（P < 0.05）。
图6 评估骨软骨缺损再生的质量
2.总结与展望
总之，本文使用这种骨软骨混合植入物成功修复了兔模型中股骨滑车5毫米直径的骨软骨缺损，生成了与天然骨软骨组织相似的透明软骨和软骨下骨。改善的结果可以归因于混合骨软骨植入物的生化和生物力学优化成分，以及能够耐受缺氧且具有最小侵入性的更多软骨生成自体PBMSCs。这里描述的混合策略的适用性不仅限于本研究中描述的特定器官类型。将强聚合物支架与类似ECM的水合材料结合，可以产生模仿骨软骨组织的生物和生物力学性质的可生物吸收构造。它在多孔支架和水凝胶之间取得了平衡，解决了聚合物材料的低生物活性、生长因子可能的致癌性和快速降解以及骨软骨组织的机械不匹配问题。这种方法在开发用于治疗人类组织缺陷的新型组织工程植入物方面具有巨大潜力。
文章来源：
https://doi.org/10.1016/j.nantod.2024.102539
