体外培养或培育的肉类、动物肌肉和脂肪组织（即人造肉）可以改变全球肉类市场，减少动物痛苦，同时比传统肉类生产使用更少的资源，并且无需抗菌剂。为了增加人造肉对人们的吸引力，培养脂肪对于实现理想的口感、味道和质地至关重要，尤其是牛肉。
在这项工作中，来自德国罗伊特林根应用科学大学的Petra J. Kluger教授团队展示了在静态和动态悬浮培养中建立原代牛脂肪干细胞球体。使用单步协议成功分化球体。来自动态培养的分化球体在食用结冷胶中进行生物3D打印时保持稳定性和活力。此外，分化球体的脂肪酸组成与对照球体有显著不同。细胞在无抗生素条件下培养，以最大限度地减少有害物质的使用。这项工作为3D动态细胞培养系统中具有高细胞密度的培养脂肪提供了一种稳定且可生物打印的构建块。
相关研究成果以“Dynamically cultured, differentiated bovine adipose-derived stem cell spheroids as building blocks for biofabricating cultured fat”为题于2024年10月22日发表在《Nature Communications》上。
1.培养肉商业化的挑战及解决方案
为人造肉开发动态bASC球体培养是一个微妙的过程，不仅需要关于bASC分离、培养和分化的稳定知识基础，还需要解决人造肉研究和生产的挑战。图1a简要概述了人造肉的发展路径，包括人造肉商业化需要解决的一些最重要的技术、财务、消费者和监管差距。在这项研究中，作者主要解决了这些发展路径的关键方面，为高效和可扩展地生产培养脂肪提供了清晰的路线图（图1b）。
图1 CM商业化的障碍和技术壁垒
2.优化一步分化方案
作为建立稳定球体培养的第一步，需要分离和鉴定bASC，同时需要简化和优化分化方案。从成年牛废弃物中酶促分离bASC，每克脂肪组织可产生约283,500 (± 182,000)个细胞（图2a）。在确定生长动力学时，发现指数期的倍增时间为25.73 (± 3.59) 小时（图2b）。分离的细胞表现出成纤维细胞样形态，并分析了不同CD标记物的表达以验证细胞身份。发现细胞对标记蛋白CD73、CD90和CD105呈阳性，但不表达CD56（图2c）。分化协议的优化通过使用rosiglitazone（罗格列酮）、胰岛素和地塞米松三种化合物作为诱导剂，简化了原有的多步骤分化协议。通过对比不同的分化诱导剂（如indomethacin和rosiglitazone），发现rosiglitazone在促进脂质积累方面更为有效，图2d和图2e展示了使用不同诱导剂处理后细胞的形态变化，而图2f和图2g进一步证实了优化协议在支持脂肪细胞分化方面的有效性。此外，研究还涉及了优化分化协议对于后续3D生物打印应用的意义，证明了这种单步分化协议不仅提高了分化效率，还保持了细胞的稳定性和活性，使其适用于3D打印中。这为未来在实际生产中应用培养肉提供了技术支持，突显了该分化协议在培养肉领域的潜在应用价值。
图2 bASC的特征
3.建立原代bASC的静态球体培养物
作者成功分离和表征原代bASC后，建立了静态3D球体培养。使用液体覆盖法，在静态条件下两天内即可形成球体。总体而言，球体呈现出均匀的圆形，边缘锋利光滑。球体在形成后14天在静态培养中被证明是稳定的。在培养的前5天内，球体的体积和直径减小。有趣的是，起始细胞数为50,000个细胞的球体的直径保持在400 µm以上，这可以被认为高于扩散极限（图3a）。随着培养时间的延长，研究者进一步分析了球体内细胞的活性和死亡情况。通过使用特定的细胞死亡标记物（如cleaved caspase-3, RIPK3, 和Hif-1α），研究人员证实，在14天的培养期间，无论是在分化介质中还是在增殖控制条件下，球体内的细胞均保持活性，并未出现显著的细胞死亡。图3b和图3c提供了有关这些标记物在不同时间点的表达情况，显示球体在培养过程中的稳定性和细胞的健康状态。
此外，通过分化介质培养的球体展示出了更大的直径和脂质的积累，这表明分化介质有效促进了脂肪细胞的成熟。通过对PPARγ和perilipin 1这两种脂肪细胞分化标志的表达进行分析，研究人员验证了分化过程的成功。如图3d和图3e所示，分化后的球体中的脂质在球体的外部和内部均有积累，这些结果进一步证实了静态培养系统在支持脂肪细胞分化方面的有效性。
图3 在第1天和第14天的维持(Ctrl)和脂肪形成分化(Diff)期间对含有50,000个细胞的静态原代bASC球体培养物进行评估
4.bASC球体可以动态培养/分化
扩大规模是人造肉研究和开发的主要关注点之一。因此，使用轨道振荡器建立了bASC球体的动态悬浮培养。动态悬浮培养中的牛ASC球体在两天内形成。培养皿中形成的球体大小各异。球体的大小受摇动速度和培养密度的影响。对于球体的维持和分化，摇动速度为80 rpm可使球体的尺寸分布最有利，同时保持细胞活力。球体的形态为椭圆形至圆形，边界清晰，不像静态培养中那样均匀（图4a）。使用与2D细胞培养相同的分化方案，细胞分化14天。培养或分化期结束后，选择最大的球体进行分析，以确定球体核心中可能的细胞死亡（图4b）。与静态培养中的球体相比，球体中均未发现三种细胞死亡标志物。发现动态球体内的PPARγ表达在第14天均匀分布在分化球体中，而在对照球体中未发现任何表达（图4c）。此外，表达perilipin 1的细胞均匀分布在分化球体中，而在未分化对照组中找不到（图4d）。此外，分化球体在分化培养基中培养14天后，细胞分布均匀，球体内有脂质积聚（图4e）。脂质积聚不仅限于直接暴露于培养基的区域，在球体核心中也可见。
图4 在第0天和第14天的维持(Ctrl)和脂肪形成分化(Diff)期间对动态bASC球体培养进行评估
5.bASC球体适合3D生物打印
为解决bASC球体是否适合用于制造人造肉产品的问题，作者研究了球体在基于GG的生物墨水中的可打印性。当分析和量化生物墨水的粘性和弹性模量时，其剪切稀化行为变得明显。在高达 ~37 °C 的温度下，弹性模量高于粘性模量，表明凝胶化，因此打印稳定性和保真度更好（图5a）。此外，反转测试支持粘性和弹性模量的发现。因为生物墨水在37 °C下流动并在室温（23 °C）下凝胶化。有和没有球体的生物打印宏观网格（1.5% GG）的分辨率（图5b）不仅证明了可接受的打印保真度，而且球体在整个生物墨水中的分布也规则。球体在生物打印网格中显示为白点。
尽管球体大小不一，但它们在打印的结构中分布相当均匀（图5b）。细胞分析表明，生物打印后（1小时）和培养三天后，球体表现出高细胞活力。虽然球体中的大多数细胞都是活的，但球体中的少数细胞显示出乙锭同型二聚体-1染色，表明一些细胞死亡（图5c）。用BODIPY对细胞内脂质进行染色，发现生物打印球体染色均匀，因此脂质在整个球体中积累（图5d）。球体稳定性和分化不受生物打印过程的影响。
图5 使用GG基生物墨水对分化的bASC球体进行3D生物打印
6.bASC球体和牛脂肪的脂肪酸组成
随后，作者探讨了经过培养和分化处理的牛脂肪来源干细胞（bASCs）球体与天然牛脂肪组织在脂肪酸组成上的差异。研究显示，虽然所有样本中的饱和脂肪酸（SFA）含量较高，但经过分化的球体、控制球体和天然牛脂肪之间在单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）的比例上存在显著差异。如图6b和图6c所示，分化后的球体中SFA的含量明显低于控制组和天然脂肪组，而MUFA和PUFA的含量则显著高于其他两组。
此外，分析还详细探讨了不同类型脂肪酸的分布情况。在所有样本中，棕榈酸（C16:0）是最常见的脂肪酸，但在分化的球体中，其含量略低于控制组和天然脂肪组。相对的，油酸（C18:1 cis）在分化球体中的比例最高，这表明分化介质可能促进了油酸的合成或积累。这些发现在图6d和图6e中得到了具体的体现，展示了各组样品中不同脂肪酸的详细比例。
图6 球体和天然牛脂肪组织的脂肪酸组成
综上，本文主要强调了使用牛脂肪来源的干细胞（bASCs）在静态和动态条件下形成的球体，具有在实验室条件下生产培养肉的潜力。研究证实，通过优化的单步分化协议，可以高效地促进bASCs的脂肪分化，并通过3D生物打印技术成功地将分化的细胞用于构建肉类产品的模型。此外，研究还表明，通过调整培养和分化条件，可以控制球体中的脂肪酸组成，从而潜在地改善培养肉的营养价值和口感。
作者还强调了此项技术对减少动物痛苦、降低环境影响、减少资源消耗的潜在贡献，并展望了未来工作的方向，包括改进生产流程的效率和成本效益，以及进一步优化培养肉产品的质地和味道，以提高消费者接受度。此外，结论部分还提到了在商业化和规模化生产前需要克服的技术和监管挑战，指出了未来研究的可能方向，如探索不同细胞源和进一步改进生物打印技术。
文章来源：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-53486-w
