2024年，伦敦国王学院的Khuloud T. Al-Jamal在《Nature Nanotechnology》杂志上发表了题为“Cellular uptake and in vivo distribution of mesenchymal-stem-cell-derived extracellular vesicles are protein corona dependent”的论文。
本文主要研究了间充质干细胞衍生的细胞外囊泡（EVs）在体内的摄取和分布，发现这些EVs的行为受到蛋白质冠层（protein corona）的影响。研究通过比较不同培养条件下的EVs，探讨了蛋白质冠层组成对EVs在体外条件下的潜在影响及其在体内的动力学。研究发现，白蛋白的结合可以改变EVs的靶向性，使其从肝脏巨噬细胞重新定向到肝细胞、肝窦内皮细胞和肝星状细胞，显著提高了这些细胞的摄取。这一现象可以作为一种伪装策略，通过预先用白蛋白涂层EVs来制造富含白蛋白的蛋白质冠层-EV复合物，增强肝脏中非吞噬细胞的摄取。这项工作通过定制蛋白质冠层-EV复合物来解决静脉注射EVs在肝脏治疗中面临的挑战，实现了对肝细胞的靶向和免疫逃逸。
01：摘要
间充质干细胞来源的细胞外囊泡（EVs）因其再生和免疫调节特性，有望成为治疗肝脏疾病的新型纳米疗法。然而，吞噬细胞对外源性EVs的快速清除引起了人们的关注。在这里，我们探索了蛋白质冠对来自两种培养条件的EVs的影响，其中从培养基中获得的特定蛋白质同时吸附在EV表面。此外，通过用血清孵育EV，模拟全身递送后蛋白质冠的形成，进一步研究了蛋白质冠EV复合物的解析模式。我们的研究结果揭示了体外条件下电晕成分对EVs的潜在影响及其体内动力学。我们的数据表明，结合的白蛋白会产生一种EV特征，可以重新定位来自肝巨噬细胞的EV。这导致肝细胞、肝窦内皮细胞和肝星状细胞的细胞摄取显著改善。这种现象可以通过在EV上预涂白蛋白来作为一种伪装策略，以制造富含白蛋白的蛋白质冠EV复合物，从而增强肝脏中的非吞噬性摄取。这项工作通过调整蛋白质冠EV复合物以实现肝细胞靶向和免疫逃逸，解决了静脉注射EV用于肝脏治疗面临的关键挑战。
02：图文赏析
2D和3D培养的EVs在物理上具有可比性
分别对来源于2D和3D MSC培养物的无血清条件培养基（CCM）和含KnockOut血清替代物（KO）的CCM进行EV分离。点印迹分析（图1a）显示EV2D和EV3D对经典四跨膜蛋白（即CD81、CD9和CD63）呈阳性。内体相关蛋白TSG101在两个EVs中的表达证实了它们的内体起源15。2D和3D培养的分离的无条件培养基的零microBCA读数证实，培养基中存在的游离蛋白质不能被共分离（补充图1）。通过微米BCA（microBCA）和纳米粒子追踪分析（NTA）分别确定的EV总蛋白含量与颗粒浓度相关（图1b）。EV3p的蛋白质含量高于EVzp，这与EV2D（3.0±0.5×1010）和EV3p（9.7±0.5×1010）的颗粒与蛋白质比（P:P）分别增加三倍相一致，两者均在报告的可接受纯度范围内1。根据ζ电位值（图1c）和粒径（图1d）确定，EV2p和EV3p的表面电荷相同，通过平均值、众数和粒径分布确定（代表性NTA和透射电子显微镜结果见补充图2），表明获得了可接受的EV电荷/粒径范围。
培养条件对ev的蛋白冠特性有影响
为了在体内模拟EV血清-蛋白质相互作用，将EV2D和EV3D暴露于50%（v/v）的EV贫化胎牛血清（FBS）（EV-D FBS）中，并进行超速离心和蛋白质冠解吸，以获得具有结合的硬冠（HC-EV2D和HC-EV3D）、硬冠（即剥离后与EV相关的蛋白质，HC2D和HC3D）和剥离的EV（条-EV2D与条-EV3 D）的EV（程序见补充图3）。对方案进行了优化，以有效解吸HC（补充表1和2以及补充图4）。如图2a所示，在去除未结合的FBS蛋白后，发现HC-EV2D和HC-EV3D的尺寸明显大于未孵育的EV。尽管如此，仍没有观察到ζ电位的显著变化。通过microBCA测定测得的每表面积结合的蛋白质也有所增加，表明额外的蛋白质是从EV-D FBS中获得的（图2b）。通过将消化的EV、HC-EV、HC、剥离的EV、EV-D FBS和KO装载到十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE）凝胶上并进行银染，对蛋白质条带进行可视化（图2c）。KO和EV-D FBS被纳入研究，以确定哪些蛋白质是从FBS孵育中获得的，而不是从EV中固有的蛋白质中获得的。可以观察到EV2D和EV3D之间不同的蛋白质谱，EV3D显示出与EV2D中不存在的KO培养基蛋白质的相似性。这一发现被证实与细胞几何形状无关（补充图5）。当暴露于EV-D FBS时，在EV表面形成HC，导致在比较HC-EV2D和HC-EV3D时，蛋白质以不同的优先成分吸附在EV上。在HC2D和HC3D条带中也观察到类似的蛋白质模式。在剥离的EV2D和剥离的EV3D样品中，蛋白质条带的差异消失了。总之，结果表明，培养补充会影响EV的蛋白质特性以及暴露于外源蛋白质（即血清中的蛋白质）后形成的蛋白质冠。为了区分形成的冠的类型，我们将CCM和FBS培养获得的蛋白质冠分别称为初级冠和次级冠。
蛋白冠在体外调节细胞摄取
由于本研究中的EV是为了增加吞噬细胞以外的肝细胞中的积聚而制备的，因此巨噬细胞和肝实质细胞对EV（无HC的EV和HC包被的EV）的摄取在吞噬细胞中进行了体外模拟，即J774和人单核细胞衍生的巨噬细胞（Hu-Ø）和人肝细胞癌细胞系HepG2，分别持续1小时、4小时和24小时。摄取量通过每细胞平均荧光强度信号（MFI）与未处理细胞相比的倍数增加来评估（标记原理见图8和9）。在J774和Hu-Ø中分别孵育1小时和1小时和4小时时，EV2D上HC的存在显著增加了吞噬细胞的摄取（图3a，b），而HepG2的摄取增加仅在24小时孵育时观察到（图3c）。在HC-EV3D的情况下，与EV3D相比，观察到24小时孵育时吞噬细胞摄取显著减少（图3d，e）。在HepG2中，孵育4小时后，观察到HC介导的EV3D摄取显著增加。值得注意的是，与2D对应物相比，EV3D和HCEV3D都可以优先被HepG2吸收。当通过亲脂性染料掺入标记EV时，也可以观察到这种优先行为（补充图10）。总之，结果表明，HC-EV3D在肝脏微环境中表现出有利的摄取特征，分别表现为吞噬细胞和肝细胞的摄取减少和增加。
非吞噬性肝细胞在体内表现出对EV3D的偏好
在小鼠体内进行了一项生物分布研究，以确定体外发现的差异是否在体内普遍存在。静脉注射DiR标记的EV2D和EV3D进行光学成像（标记见补充图8d，剂量信息见补充表5）。注射后24小时，如图4a所示进行全身成像（1小时和4小时生物分布见图11）。最亮的信号可以在上腹部区域检测到，对应于肝脏和脾脏的位置，注射EV3D的小鼠显示出最高的DiR信号。主要器官的离体成像支持了这一点，该成像显示，在24小时内，EV3D在肝脏和脾脏中积累最多（图4b）。对离体器官图像（归一化为器官重量）进行了半定量分析（图4c），结果表明，两种EV在脾脏和肝脏中的积聚量最高，其次是肺部和肾脏。当比较两种类型的EV在肝脏中的积聚时，EV3D组检测到更高的DiR信号（P<0.05），与体内成像一致。小鼠也被单独关在代谢笼中进行尿液校正，以检查肾脏清除率（图4d）。有趣的是，在EV2D组中检测到尿液中最高的DiR信号，证实了EV2D在循环系统中的半衰期较短。为了研究肝亚群（即肝细胞、库普弗细胞、内皮细胞和星状细胞）的体内摄取，静脉注射DiD标记的EV2D和EV3D（剂量信息见补充表5）。注射后24小时，对小鼠进行麻醉，然后进行肝脏灌注（肝脏灌注程序见补充图12）。对消化的肝脏进行差速离心，以分离肝细胞和非实质细胞（NPC）群（即库普弗细胞、内皮细胞和星状细胞）（分离程序见补充图13）5。然后用荧光偶联抗体对细胞组分进行染色，以检测这些亚群表达的标记物，从而能够通过流式细胞术与EV的DiD信号共定位进行细胞类型鉴定（抗体面板和门控策略见补充图14）。肝脏亚群的分离数量一致（补充图15）。DiD信号也与肝细胞中的抗人抗CD9抗体信号共定位，证实了EV在体内的标记稳定性（补充图16）。如图4e、f所示，大多数库普弗细胞（90%）对EV2D和EV3D没有偏好，而在其他细胞亚群中可以观察到差异：48.38%的肝细胞、68.15%的内皮细胞和62.38%的星状细胞对EV3D呈阳性，平均荧光强度（MFI）值分别为13338.5、5219.75和4478。EV2D样本的值显著降低，肝细胞、内皮细胞和星状细胞的阳性细胞百分比和MFI值分别为24.25%、33.88%、23.15%和1868、1538、1237。总之，巨噬细胞对EV类型的摄取漠不关心，而肝细胞和内皮细胞，其次是星状细胞，似乎更倾向于摄取EV3D而不是EV2D，这可以解释EV3D的整体较高肝脏信号。
EV的包被作用可预测地依赖于蛋白质冠层
为了了解EV的体外和体内行为、生物过程和蛋白质冠组成之间是否存在相关性，对LC-MS鉴定的EV和HC蛋白质进行了基因本体论（GO）分析。为了关注可能在细胞摄取中发挥作用的EV蛋白，只选择了编码为细胞外空间且高度富集的蛋白质（P<0.001，补充图17）进行进一步分析（蛋白质登录代码见补充表6）。随后，分别针对人类和牛数据库（UniProt），通过生物过程对EV和HC集进行了富集分析。通过PCA定量分析与显著富集过程相关的蛋白质（图5a，b），以获得一组称为主成分（PC）的新变量，对应于原始变量的线性组合。图5c、d所示的评分图分别显示了仅考虑PC1时EV和HC之间的差异（见图18）。在检查负荷图以确定每种成分影响最大的变量时，免疫球蛋白重常数μ强烈影响了PC1上EV2D和EV3D之间的分离（图5e）。EV2D上这种蛋白质的丰度更高（Bi图见补充图19a），使其更容易被吞噬细胞吞噬，并诱导补体激活（经典途径），如相关蛋白质功能（UniProt数据库）所解释的那样。HC样品的负载图（图5f）表明，α-2-HS-糖蛋白对HC2D和HC3D的分离在HC3D中更为丰富。第二个最有影响力的蛋白质是补体C3，它与各种蛋白质共线性，这些蛋白质通过几个过程在EV清除中起着重要作用。补充表3和4显示了蛋白质含量，补充表7和8显示了对生物过程的贡献。HC2D中这些高度相关的蛋白质的丰度较高（Bi图见补充图19b）表明，在全身暴露后，EV2D的清除是通过调理、补体激活和吞噬作用促进的
3：原文链接
https://doi.org/10.1038/s41565-023-01585-y
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