微载体是直径在60 ~ 250 um的微珠。1967年,Van Wezel率先用离子交换树脂DEAE-SephadexA-50制成微载体,用于培养细胞。微载体培养与单层细胞培养相比,为贴壁细胞提供了更大的培养表面积,从而使细胞的产量大大增加,而且易于控制,减少了污染的危险,使大规模生产成为可能。无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外正常生长繁殖的合成培养基,其克服了含血清培养存在潜在污染源及不利于下游分离纯化等缺点。2010年,美国、欧盟等发达国家将全面停止在生物制药中应用血清。各国对采用添加牛血清的培养液生产的疫苗的控制也越来越严格。
无血清微载体培养需添加的组分
无血清微载体细胞培养,由于不含血清,会缺少细胞生长所需的激素、生长因子等营养物质，因此需添加合适的补充因子,其中包括:①促贴壁物质:如纤连蛋白、层黏连蛋白等;②促生长因子及激素:如胰岛素:③酶抑制剂:培养贴壁生长的细胞,需要用胰酶消化传代,在无血清培养基中需含酶抑制剂,以终止酶的消化作用,达到保护细胞的目的,最常用的是大豆胰酶抑制剂；④结合蛋白和转运蛋白：常见的如转铁蛋白和白蛋白,可增加培养基的黏度，保护细胞免受机械损伤;⑤微量元素。这样的无血清培养基仍含有较多的动物蛋白,如胰岛素,转铁蛋白、白蛋白等。而对应用于人体的细胞产品,如果在生产过程中使用了含有动物蛋白质的培养基,纯化过程就会比较复杂。可通过添加植物水解物替代动物激素、生长因子的作用。
微载体的种类对无血清微载体培养的影响
微载体的种类和特性是影响无血清微载体细胞培养的重要因素之一。研究发现,无血清会加重搅拌所产生剪切力对细胞的伤害[1.2],因此,在无血清培养中要选用易于吸附细胞,并可保护细胞,减少剪切力伤害的微载体。何春艳等[3] 研究发现，Vero 细胞对Cytodex 1、DH微载体的吸附能力很低,但对Cytodex 3在24 h吸附率即高达90%。细胞吸附到微载体上包括两个过程:① 细胞与微载体表面建立稳定接触的物理过程,这个过程常常可通过电荷相互作用力来介导;②细胞在微载体上建立点接触的生物学阶段。DH微载体和Cytodex 1虽然可通过电荷相互作用吸引带负电荷的细胞,但在无血清条件下,由于缺乏外源的黏附因子,细胞吸附效率较低。Cytodex 3在葡聚糖骨架上共价连接了降解的胶原分子,在吸附的生物学阶段提高了细胞吸附的效率,适合Vero细胞在无血清条件下的培养。Fernandes等[2发现,使用Cultispher S微载体(多孔微载体),对小鼠胚胎干细胞在无血清条件下的增殖有保护作用。细胞可在多孔微载体表面及孔内生长和增殖,减少了剪切力的损伤[4.5]。
生物反应器类型对无血清微载体培养的影响
在无血清条件下,细胞对生长介质的吸附能力降低，由于搅拌产生的剪切力，使细胞生长受到严重的危害,因此需要使用剪切力小、混合性能好的新型生物反应器。用于无血清微载体培养的生物反应器有以下几种。传统的搅拌式生物反应器,虽然会产生较大的剪切力,但简单、实用、经济。在合适的培养条件下,一些细胞可在搅拌式生物反应器中正常生长[2]。旋转生物反应器是将接种细胞的微载体移入培养容器内,并加满培养液,整个容器沿水平轴旋转。细胞微载体颗粒在水平方向均质悬浮,随容器一起旋转,不与容器壁和其他物质相撞,细胞通过膜式气体交换器来吸氧和排出CO2,可为细胞提供破坏性剪切力极低的生存环境[47)。波浪生物反应器可以培养悬浮细胞，或在微载体上培养贴壁细胞,是以不同角度、不同速度摇动培养基,以顶空换气的方式供氧。通过传感器控制pH值和p0,能很好地控制pH值,这对于收获高产量病毒极其重要。其还可以选择灌注的方式更换培养液a9,与滚筒和搅拌反应器比较,能为细胞提供更低的剪切力环境,使细胞的贴壁性更好。在大量生产中,波浪生物反应器是搅拌反应器很好的替代品[使用灌注培养的模式也是无血清微载体培养很好的方式。研究发现,灌注培养得到的细胞密度较高,而乳酸分泌量较低。使用灌注培养总的病毒滴度比培养瓶培养高8倍。通气方式为表面曝气,若使用喷射的方法,会产生大量泡沫,对细胞是有害的[1]在无蛋白培养基中可加入剪切保护剂,如PluronieF-68来保护细胞[z], wu等[13]报道,使用硅树脂管无气泡换气方式培养Vero细胞也取得较好的效果。
无血清微载体培养条件下细胞的新陈代谢
无血清培养条件下,细胞的葡萄糖消耗量低于含血清培养,这是由于在无血清培养中,细胞生长期产生了较高浓度的丙酮酸,代替了葡萄糖,减少了葡萄糖吸收和乳酸释放[210415),在无血清微载体培养条件下,低的葡萄糖浓度并不影响细胞的生长和病毒的繁殖。多余的葡萄糖被用来产生乳酸,而高浓度的乳酸会抑制细胞生长。因此，在无血清培养中应降低培养基中的葡萄糖浓度。另外，有报道证明，无血清培养中，由于高的丙酮酿含量，即使在无谷氨酰胺的条件下，细胞的生长和病毒的繁殖均不受影响[6。无血清培养基中总氨基酸的浓度很高，是含血清培养基的 3 倍，特别是非必需氨基酸。因此在无血清微载体细胞培养过程中，无需再补充氨基酸[]。无血清微载体培养的pH 值的稳定性不如含血清培养。在无血清培养兽用流感病毒中，只有通过接种病毒前的洗涤和培养基更换过程才能有效地控制pH 值。Genzel 等[1a时]研究发现，无血清培养中 pH值的降低,使得病毒滴度下降。无血清培养时,钠含量较含血清培养时低,这会导致谷氨酰胺吸收率的降低。
无血清微载体培养中使用的胰酶替代物
在细胞消化过程中，需要使用胰酶，但在无血清条件下，胰酶会导致细胞的瞻性增加，并伴有部分膜破裂的现象，而且会引入动物成分，如大豆映酶抑制剂,来抑制映酶活性。因此,需要选择映酶的替代物或尽量减少映酶的使用。Rourau等1]使用了无动物和人组分的商用培养基培养Vem细胞，在传代中使用了两种酶代替陝酶：重组映酶和 Aeeutase（一种来自甲壳类的酶，含有胶原酶和蛋白酶活性。使用重组胰酶,细胞的生长情况较好。而且,这两种酶均不需要大豆胰酶抑制剂,重组胰酶提高了细胞在微载体Cytdex 1上的贴附、伸展及正常生长的能力,并获得了与含血清培养相同的细胞密度。证明了使用重组残酸消化细胞的可行性。Genzel等M研究发现,在无血清培养基中,MDCK细胞贴附微载体的能力可通过加入Cr提高,收获细胞时，可只使用 EDTA/PBS 而不使用胰酶。增加映酷用量和病毒的感染复数,不会提高病毒滴度。相反,减少胰酶的用量会提高病毒滴度。
无血清微载体细胞培养的应用
用于制备疫苗和免疫球蛋白：目前，无血清微载体细胞培养工艺已应用于肠道病毒EV71、流感病毒、呼肠病毒、脊髓灰质炎病毒、乙型脑炎病毒、狂犬病病毒等的培养[m]。在适当的培养条件下，能获得与含血清培养相同的细胞密度及病毒收获量。无血清培养省去了在感染病毒前的洗涤过程和培养基更换的步骤,避免了由此带来的污染,降低了生产成本，简化了下游纯化。无血清培养比含血清培养能够获得更高滴度的病毒。这可能是由于无血清培养接种病毒后细胞的死亡率显著高于含血清培养，感染细胞容易从微载体表面脱落[，而且培养的病毒有更好的抗原稳定性。无血清培养对于蛋白重组产品是很有利的。Vekz等2使用无血清微载体培养Cos-1细胞,获得登革热4型量组病毒祥颗粒,排除了含血清培养蛋白含量高的问题,提高了产品的安全性、稳定性和有效性，并降低了生产成本。Maas 等 2研究发现，在无血清培养条件下。HL.细胞对肺炎衣原体的敏感性提高。这是由于血清中的寡德和糖蛋白会抑制宿主细胞与细菌的相互作用。Marelino等1应用无血清微载体培养反刍动物上皮细胞，生产立克次体埃利希属 ER 的灭活细菌疫苗,结果显示,无血清培养使ER的接种量减少了6倍,使得大规模生产成为可能。Voigt等采用微载体技术在无蛋白培养基上制备抗神经编细胞单克隆抗体。由于无蛋白培养基中的蛋白均来自于细胞分泌的产物，因此大大简化了下游纯化过程。制得的免疫球蛋白G的产量是含血清普通静置培养的2.5倍6.2 用于制备组织工程细胞：胚胎干细胞可以在体外分化出各种细胞，可用于组织再生。但要应用于组织培养需要有大量的种子细胞,并且需要使用化学成分确定的培养基来控制细胞的分化。Femandes 等应用无血清微载体技术培养小鼠胚胎干细胞,获得的细胞密度略高于含血清培养细胞的代谢也基本相同。更为重要的是,无血清培养在连续搅拌8d后，细胞仍具有分化成神经系统的潜能。Frerich 等[叫利用微载体形成血管组织体外模型,发现无血清培养对毛细管结构有显著的保护作用，使得毛细管结构的直径更加稳定，而且通常相互交联,长度更长。Li等 使用明胶颗粒作为微裁体,在无血清条件下,获得了大量自身同源黑色来细胞，通过细胞移植，为大面积白斑病的治疗提供了可能。
