关节软骨退化，这可能是由于受伤、年龄增长或关节炎引起的，导致显著的关节疼痛和残疾。目前，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的唯一针对关节软骨损伤的细胞疗法是自体软骨细胞植入（ACI），但这一过程成本高昂、耗时且需要多次治疗。间充质干细胞（MSCs）作为一种吸引人的自体疗法选择，因为它们易于获取，并且能够分化成软骨细胞以供移植，具有良好的安全性。然而，由于供体间变异性、群体内异质性以及MSC制造协议的非标准化，治疗效果存在差异。因此，需要改进过程，以减少细胞异质性，同时在扩增培养期间增加供体细胞数量，并提高软骨生成潜力，以实现MSC疗法的全部潜力。
研究简介
在扩增期间通过调节MSC的代谢来增强其软骨生成承诺的潜力，通过改变培养基中的营养组成，包括葡萄糖、丙酮酸、谷氨酰胺和抗坏血酸。研究发现，在MSC扩增期间添加1 mM L-抗坏血酸-2-磷酸（AA）可以改善软骨生成分化。此外，AA处理减少了衰老细胞的比例和细胞异质性，也允许长期扩增，导致MSC产量增加了300倍以上，与未处理细胞相比，具有增强的软骨生成潜力。AA处理的MSC显示出代谢轮廓向氧化磷酸化（OXPHOS）的显著转变，并且具有更高的微磁共振弛豫时间（µMRR T2）值，这识别了可以应用于MSC制造中用于关节软骨修复的关键质量属性。
通过靶向MSC代谢并整合扩增过程中的过程分析工具，可以改进MSC制造过程，从而增强软骨生成潜力。具体来说，AA处理的MSCs在软骨生成分化方面表现出了显著的改善，这通过增强的关节软骨基质、糖胺聚糖（sGAGs）和II型胶原（Col2）的产生来衡量。尽管在不同供体中观察到了不同的剂量反应曲线，但在所有4个供体中，1.0 mM AA的浓度一致地观察到了软骨生成潜力的显著增加，因此后续实验中使用了这种浓度。
研究还测量了AA处理对成骨和成脂分化的影响。结果显示，与未处理对照组相比，AA处理在MSC扩增期间改善了软骨生成分化，而在成骨和成脂分化方面未观察到差异。通过比较软骨生成、成骨和成脂分化的标准标记物，研究发现AA在扩增期间的补充特别改善了软骨生成分化。此外，流式细胞术分析显示，未处理和AA处理的MSCs在扩增后均显示出对CD73、CD90和CD105的阳性染色，对CD34和CD45的染色最小，表明AA处理并未改变整体MSC质量。
AA处理对MSC代谢状态的影响。数据显示，MSC的软骨生成潜力与糖酵解呈负相关，与氧化磷酸化呈正相关。因此，研究调查了AA处理后MSC的代谢状态。使用Seahorse通量分析仪，监测了OCR（氧化磷酸化的指标）和ECAR（糖酵解通量指标）。在基础水平上，AA处理的MSCs显示出比未处理MSCs更高的OCR和更低的ECAR（更高的OCR:ECAR比率），表明增加了氧化磷酸化。AA处理的MSCs降低的糖酵解特性进一步得到了在培养基中测量到的较低的葡萄糖消耗和乳酸产生率的支持。
AA处理的MSCs在µMRR T2值和悬浮细胞直径上表现出差异。AA处理已被报道可以维持MSC在培养中的增殖。与先前的研究一致，研究发现7天的1 mM AA处理导致4个供体的群体倍增时间（PDT）减少和高度相似，与未处理MSCs相比，后者在PDT上表现出异质性。MSC在AA处理后的增殖被归因于其抗氧化活性，这可能减少了扩增期间的衰老细胞比例。衰老细胞的一个标志是细胞大小的增大。在先前的研究中，细胞直径大于23 μm的MSCs与细胞衰老相关，而细胞大小在17至21 μm之间的MSCs显示出更好的软骨生成潜力。值得注意的是，与未处理对照组相比，AA处理的MSCs显示出显著较小且更均匀的悬浮细胞直径。
研究还发现，AA处理的MSCs在P4时显示出改善的增殖和软骨生成潜力，与未处理MSCs相比，在所有4个供体中µMRR T2弛豫时间显著更长。这些数据表明，AA补充维持了铁代谢平衡并减少了氧化应激，这也得到了群体倍增和衰老细胞比例显著减少的支持。研究结果支持将µMRR作为扩增MSCs用于细胞疗法的过程监测工具的潜力。
在当前实践中，由于随着传代次数的增加，细胞活力的丧失和衰老细胞以及细胞异质性的增加，MSCs通常在P4时收获用于治疗应用。鉴于短期AA补充改善了软骨生成，研究测试了AA补充是否可以改善长期传代的MSC扩增。与上述相同，P1的MSCs在标准扩增介质中恢复1个传代。然后，从P2到P9，用1 mM AA（AA）或0 mM AA（未处理）补充扩增介质（图4A）。在P9收获MSCs，并进行软骨生成、成骨或成脂分化（见方法）。研究发现，长期AA处理特别改善了软骨生成潜力4.1倍，而对成骨或成脂潜力的影响最小或没有观察到（图4B-E）。长期AA处理对软骨生成潜力的改善也得到了SOX9基因表达水平更高的支持。还观察到了类似的代谢向氧化磷酸化的转变，这表明OCR:ECAR比率显著更高，并且葡萄糖消耗和乳酸产生率降低。
细胞衰老和异质性被广泛认为是MSC制造中的瓶颈。同样，研究观察到未处理的MSCs随着传代次数的增加，细胞大小范围增加。相比之下，AA补充减少了P9时悬浮细胞直径的异质性。在后期传代中，AA处理和未处理MSCs之间的贴壁细胞形态变化也被测量，其中未处理的MSCs获得了衰老样的扁平和增大的形态，而AA处理的MSCs保持了P4 MSCs典型的纺锤形形态。与未处理的MSCs相比，用AA扩增的MSCs还显示出减少的β-半乳糖染色和较少的具有特征性较大、扁平细胞形态的细胞。研究还注意到，AA处理的MSCs有一个显著更长的平均µMRR T2弛豫时间，与较低的Fe3+、减少的衰老细胞比例和改善的软骨生成潜力一致。
接下来，研究测量了AA处理MSCs在每个传代直到P9的PDT，与未处理MSCs相比，整个扩增过程中测量到的PDT更短（P9时分别为3.6天和17.84天）。注意，AA处理的MSCs的PDT在整个扩增过程中保持一致，与未处理MSCs相比，表明稳定的增殖率。累积群体倍增水平（CPDL）也显示AA处理的MSCs比未处理MSCs有所增加。研究证明，以105个细胞播种，可以在长期扩增条件下，通过AA处理获得近300倍的增加，达到>450亿个细胞，而在未处理条件下只有0.14亿个细胞。增殖的差异可能是由于未处理对照组中衰老细胞比例的增加和整体细胞健康状况的下降。因此，在扩增期间实施AA补充和通过µMRR监测可以为改善细胞疗法制造提供简单策略，特别是针对特定适应症的MSCs。总而言之，研究中观察到的增加的产量、减少的群体异质性和改善的软骨生成能力可以满足强健生产临床级MSCs用于软骨修复的未满足需求。
原文链接：
https://doi.org/10.1186/s13287-024-03923-w
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