伴随着单细胞转录组掀起的科研热潮，随之而来的就是百花齐放的单细胞转录组分析方法。在先前的推送中我们曾介绍了scWGCNA和拟时分析。对于拟时分析这种最普适的单细胞转录组分析方法来说，不仅仅只有构建分化轨迹的方法。今天要介绍的分析点是拟时分析的“亚种”——细胞周期分析。
细胞周期是细胞DNA复制、生长和分裂的一系列事件。生物的生长发育基于细胞的发生发展，在这一过程中细胞分裂增殖的活性都非常高，而这些增殖中的细胞都处于细胞周期中，通过对增殖细胞的研究，可以获得细胞周期各时期的特征基因的表达情况，从而对其进行细胞周期的划分，这就是细胞周期分析。
细胞周期分析主要应用在医学研究领域，比如肿瘤微环境、机体发育这种细胞组成比较复杂并且细胞增殖分化较为活跃的研究。传统的细胞周期分析通常是通过实验标记，比如碘化丙啶染色、CCK8实验等，这种传统的方式实验相对复杂，并且可用的标记也有限。与之对应，单细胞转录组的实验不仅简单、快捷，对从中获得的高分辨率的细胞转录图谱信息进行定量分析就能得到每个细胞所处的细胞周期信息，真正做到了“鱼与熊掌兼得”的细胞周期分析。
图一：细胞周期是一个动态循环的过程
基于基因表达评分的“拟时分析”
与细胞分化的过程类似，细胞增殖的过程同样伴随着部分基因在时间上的规律变化，正因为与时间这一因素相关，所以可以将细胞周期看作拟时分析的一个“亚种”。从分析上来说，细胞周期分析是基于已知的基因集（细胞周期相关基因）进行分析，而拟时分析则是在不确定哪些基因是与分化相关的情况下进行的分析。对于细胞周期分析，基于细胞周期基因的表达情况，就可以把细胞按照时间顺序进行分类，不难看出，本质上细胞周期分析就是对已知基因集表达的评分。下面就让我们总结一下细胞周期分析和拟时分析在各个层面上的特点吧:
1.时间维度的解析：
细胞周期分析：按照细胞周期的具体分类，研究各个细胞从一个分裂周期到下一个分裂周期所经历的不同阶段（G1、S、G2、M）。
2.动态发育过程的侧重点：
细胞周期分析：细胞周期分析侧重于揭示细胞在生长和分裂过程中的动态变化，包括DNA复制、基因表达调控等，因此基因表达波动不大，细胞本质上仍旧行使原来的功能。
3.数据分析方式的差异：
细胞周期分析：细胞周期分析仅关注固定的一些细胞周期基因表达情况，根据这些基因表达的高低划分不同的细胞周期，分析过程相对简单、快速。
4.细胞异质性的揭示：
细胞周期分析：识别和解释细胞亚群中不同细胞在周期阶段上的异质性。
细胞周期分析和拟时分析在解析生物过程的时间维度上具有相似性。虽然它们关注的具体生物过程不同，但都能基于静态数据重建动态时间过程，从而揭示细胞在发育、生长或分化过程中的动态变化。因此，细胞周期分析可以看作是拟时分析的一种具体应用形式。如下图所示，Brad Nelms和Virginia Walbot的研究[1]使用了细胞周期基因集通过PCA分析构建了各个细胞周期的玉米孢子细胞（AR）的循环轨迹，从而在静态的数据中构建了动态的细胞周期循环过程。
图二：基于细胞周期基因的PCA分析产生的循环轨迹
单细胞转录组细胞周期分析结果介绍
细胞周期分析可以通过seurat包中自带的人、小鼠的细胞周期基因集加上addmodulescore和cellcyclescoring函数进行。具体的分析流程如下图所示，下面就让我们看看具体的分析流程结果所代表的含义吧。
图三：细胞周期分析的主要流程
1.细胞周期评估
从整体的角度评估分组或者样本数据的细胞周期评分（CellCycle.Score），如果细胞周期评分越高，则这个数据中的细胞更多的处于细胞增殖的状态。
图四：细胞周期评估箱型图
2.细胞周期推断
基于细胞周期基因集在各细胞中的表达情况，将细胞分类为G1/S/G2/M/non-cycling状态，这一结果可以直观展示各细胞亚群中的细胞周期分类情况，从而帮助我们锁定潜在的关键细胞亚群。
图五：通过UMAP图的形式展示细胞亚群的细胞周期推断情况
3.周期蛋白表达可视化
以热图的形式展示各细胞周期基因集在细胞周期推断的分类结果的表达情况，可以作为细胞周期分类的依据。
图六：细胞周期基因表达热图
4.周期细胞上调基因分析
基于细胞周期推断的分类结果，对各细胞周期亚群进行上调基因分析（差异分析结合通路富集分析），从而可以寻找各细胞周期的新特征基因或者探究不同细胞周期下细胞的具体生物学过程差异。
图七：差异基因结合通路富集分析将基因与生物学过程进行关联
小 结
作为从另一种角度进行的“拟时分析”，细胞周期分析能快速还原组织样本中细胞所经历的细胞周期的动态过程，推断细胞的增殖状态，结合后续的上调基因分析，还可以将处于不同细胞周期的细胞与特定生物学过程进行关联。对于可能伴随细胞增殖过程变化的研究课题，比如细胞分化发育、药物靶点以及肿瘤微环境等，细胞周期分析也许能提供比拟时分析更有价值的线索。
相信今天对于细胞周期的大致介绍会让大家更好的理解这一分析点。不过相比起文字的讲解，在下个月马上到来的单细胞转录组培训班中，会对包括细胞周期分析在内的单细胞流程分析进行更加详细的讲解并进行实操，心动不如行动，对培训班感兴趣的各位老师还请抓紧时间联系基迪奥咨询噢！
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