为什么我们经常看到差异基因（DEGs）里的负数代表下调，正数代表上调？因为我们使用了LogFoldChange（LFC）。那为什么不使用FoldChange（FC）来表示差异倍数呢？FC的数值范围可能非常大，特别是对于那些高度上调或下调的基因。例如，一个基因的表达量可能增加了100倍，而另一个只增加了2倍。这种大的数值范围使得数据可视化变得困难，并且可能掩盖较小但仍然生物学上重要的变化。横坐标表示FC，当FC>2时，LFC>1；当FC<0.5时，LFC<-1，一般默认取LFC绝对值大于1为DEGs的筛选标准，即LFC>1时，上调；LFC< -1时，下调。通常通过两个参数进行DEGs的筛选，分别是LFC和Pvalue或者FDR。其中，LFC是两个样本一个基因表达量的差异倍数，Pvalue和FDR是两个常用的统计指标，用于评估基因表达的显著性差异。FDR提供了一个更加严格的显著性评估标准，它考虑了多重比较的影响。确保有足够的样本。样本量不足会影响Pvalue和FDR值，增加生物学重复的次数，尽量减少随机误差。去除离群样本。样本质量差会造成FDR偏高，导致最后获得DEGs数量减少。
在排除样本因素后，DEGs依旧不足时，可以初步判断是基因表达的响应本身较低，我们可以更换差异分析软件和参数，放宽筛选条件：尝试不同的统计方法或软件包，如DESeq2、edgeR或limma，它们可能对差异表达基因的检测有不同的灵敏度。通常筛选DEGs常用阈值是|LFC|＞1，FDR＜0.05。当DEGs数目过少时，可以将差异阈值放宽，比如设置为差异倍数|LFC|＞0.58，Pvalue< 0.05。能调整FC的时候，尽量还是用FDR筛选，用p值发文容易被审稿人质疑不够严谨；同理，当DEGs数目过多时，可以将差异阈值设置为|LFC|＞1.58，FDR<0.01。如果是我们基迪奥的客户，可以在Omicsmart报告的开始交互分析中调整软件、设定新的阈值，重新进行分析（还可以顺便做个DEGs的富集分析），再比较不同任务差别，选择符合预期的结果。Fig2 基迪奥Omicsmart在线报告阈值筛选Q3：在差异分析中，FDR值和Pvalue哪个更好？
在差异基因表达分析中，FDR（错误发现率）和Pvalue都是用来评估统计显著性的指标，但它们在应用上有不同的优势和局限性。P值是指在原假设（通常是没有差异或效应）为真的情况下，观察到的数据或更极端数据出现的概率。FDR是指在所有声称显著的检验中，实际上不显著的检验的比例的期望值。在实际应用中，通常推荐使用FDR阈值（如0.05）来确定哪些基因是差异表达的。如果只使用Pvalue，并将阈值设定为0.05，即便所有的实验结果实际上都是非显著的，但你依然有64.15%的可能性“观测”到至少一个“显著差异”的结果。![]()
1. 依赖性：FPKM和RPKM的归一化方法假设Counts服从泊松分布，这可能在实际情况中并不总是成立。此外，这些方法在计算中依赖于基因长度和测序深度的归一化，这可能导致表达水平估计的不准确性。而且常用的统计包如DESeq2和edgeR就是基于原始计数数据进行建模和分析的。2. 统计检验问题：FPKM和RPKM值不是原始计数数据，而是经过转换的数据。使用这些转换后的值进行统计检验可能会违反统计检验的基本假设，从而影响检验的有效性。3. 多重比较校正：差异表达分析需要进行多重比较校正，如使用FDR或Bonferroni校正。FPKM和RPKM值并不直接提供进行这些校正所需的信息。不能。edgeR和DESeq2等软件进行差异分析的时候要考虑文库的深度和reads的分布，单独提取部分目标基因进行分析会破坏样本的特征，容易导致最后的结果出现偏差。但是在Omicsmart中，我们可以在生成的DEGs表格中提取我们想要的基因进行可视化以及想要的分析。Fig4 基迪奥Omicsmart在线报告目标基因分析Q6：差异基因列表中，Counts一个不为0，能否说明一个表达，一个不表达？
1. 测序深度：如果测序深度很低，即使是表达量较低的基因也可能检测不到Counts。因此，你需要考虑样本的测序深度。2. 表达水平：基因表达水平可能非常低，低于检测限，这可能导致Counts为0。在RNA-seq数据中，表达量为0的基因可能实际上有非常微弱的表达，只是没有被检测到。3. 基因长度和转录本复杂性：更长的基因和更复杂的转录本可能更容易在测序中被检测到，即使它们的表达水平相似。Q7：某基因在两个样本中表达量差别很大，却不存在于显著差异的基因列表中，这是为何？
1. 表达量差异与统计显著性的区别：表达量的差异和统计显著性是两个不同的概念。即使两个样本之间的表达量差异很大，如果这种差异在统计上不显著，那么该基因也不会被归类为差异表达。2. 样本数量不足：样本量可能太小，导致无法检测到真正的差异表达。样本表达量之间波动很大，导致统计检验的数值偏低，可以考虑增加样本量来稳定差异，提高统计检验的准确性。3. 多重比较校正：在进行差异表达分析时，通常会使用多重比较校正（如FDR）来控制错误发现率。如果校正后的P值超过了预设的阈值（例如0.05），即使表达量差异很大，基因也可能不会出现在显著差异基因列表中。本期推送主要给大家介绍在差异分析时碰到的问题。在实际分析中，Pvalue和FDR等统计检验值都需要大家根据自己的实验适时调整，不要盲目地依赖常见的筛选阈值，最后祝大家实验顺利！如果大家对差异分析有其他的疑惑也可以在评论区留言哦~基迪奥生物测序服务能力行业领先，从方案设计、测序建库到精细数据挖掘、审稿意见回复，全程为各位老师保驾护航到文章发表，云处理分析平台Omicsmart更是让你无需任何编程基础即可随时实现数据挖掘自由。如果您有测序/分析项目咨询，可扫描下方二维码填写意向信息：![]()
![]()
*未经许可，不得以任何方式复制或抄袭本篇文章之部分或全部内容。版权所有，侵权必究。
![]()
联系方式：020-39341079；service@genedenovo.com
