细胞生存于一个复杂的微环境中，这个微环境由细胞外分子、结构基质以及邻近细胞共同构成，它们对细胞的表型和组织的功能特性具有塑造作用。单细胞转录组技术虽能展示生物体和组织中单个细胞的状态，但却无法获取培养特定细胞身份的微环境背景。而空间转录组技术（ST，Spatial Transcriptomics）的诞生，为这一困境带来了转机。它能够同时检测细胞及其周围邻近细胞的转录状态和空间位置，从而将单细胞生物学的范畴从孤立的细胞拓展到多细胞邻域，有助于揭示在不同组织和条件下细胞如何依据某种规律性和功能性组织在一起，进而行使正常的生命活动。当前，空间组织的异质性和组织形态的微环境是 ST 研究的热点所在。近年来，ST 技术不断涌现出各种检测技术，再加上近 5 年单细胞测序技术的推动，ST 在过去 5 年实现了快速发展（如图1所示）。从不同研究领域应用的发文数量来看，也呈现出井喷式增长（以肿瘤领域研究文章数量为例，虽统计可能不完全，但仍可看出发展趋势，如图2所示），其他领域的 ST 文章也陆续发表。这意味着在研究领域发表关于 ST 的文章，很可能会是抢占先机的重要举措，且有发表高分文章的潜力。图2 以肿瘤领域的研究文章统计柱状图（统计不全面）
第三类：基于感兴趣区域（ROI）的切割和测序技术。基于此，我们回顾过去几年主要的ST技术原理，为大家更全面的认识空间转录组技术提供帮助。空间转录组学的成像技术可追溯至利用荧光原位杂交（FISH）或单分子 FISH（smFISH）在单细胞分辨率下对单个 RNA 分子进行检测和可视化。之后，Nilsson 实验室对其进行了发展，通过采用锁环探针介导的转录杂交结合滚环扩增（RCA）技术来增强信号和可视化效果。在过去 5 年中，RCA 介导的原位扩增技术取得了重大进展，出现了诸如 STARmap、BaristaSeq 等方法，其基因检测能力在几百到几千左右，并且还涌现出了商业化应用的技术，比如 Xenium。10x Genomics 于 2022 年 12 月推出的 Xenium，是一种结合了原位测序（ISS）和原位杂交（ISH）技术的空间成像商业化平台。其技术原理为：平均使用 8 个带有基因特异性条形码的锁环探针（padlock probes）与目标转录本杂交，通过高度特异性的探针连接形成环状 DNA 探针，然后对其进行酶促扩增，带有预先分配的荧光染料的寡核苷酸探针与锁环探针中的基因特异性条形码杂交，在成像并去除荧光颜色后，使用不同的荧光染料重复上述过程，平均进行 8 次，以此生成用于目标基因识别的光学特征。Xenium 技术借助多轮荧光成像来识别目标基因，兼具高特异性和高通量的优点。A）在 ISS 中，逆转录的互补脱氧核糖核酸（cDNA）与含有基因特异性条形码序列的锁扣探针杂交，并在特定杂交位置进行连接，然后使用环化的锁扣引物探针通过滚环扩增（RCA）进行扩增。B）Xenium原理示意图。随着第二代测序（NGS）技术的广泛应用，空间 barcode 测序技术在空间生物学领域开辟了新的途径。由 Lundeberg 实验室开发的 ST 技术推动了该领域的发展，并最终商业化为 Visium ST（10X Genomics）。许多 ST 技术采用与空间条形码寡核苷酸对齐的寡聚（dT）引物，并运用经典的 polyA 捕获方法来识别和定量每个空间坐标的基因。由于这些 ST 技术需要 polyA 捕获，所以主要使用新鲜冷冻（FF）样本。为了拓展分析范围和提高样本兼容性，针对福尔马林固定且石蜡包埋（Formalin - Fixed and Parrffin - Embedded，FFPE）样本开发了基于探针的 ST 技术，如 Visium ST 的升级版本（包括 Visium V2 FFPE、Visium CytAssist）。这些技术的主要区别在于其上游设计，即使用基因特异性探针在原位杂交到互补的 RNA，并通过探针捕获进行文库构建和测序。这种设计优势使得全转录组探针集的设计成为可能。尽管 ST 测序的分辨率范围在每个单位 0.5μm 到 100μm 之间，但平衡空间分辨率和基因检出数量仍然是主要挑战。一些商业化技术如 Visium HD（最小分辨率 2μm）、Stereo - seq（最小分辨率 0.5μm）等，这些高精度的空间转录组技术通过 ployA 捕获或探针杂交的方式进行高通量测序，获得的基因数随着 bin 大小调整而变化，最终都能满足在细胞分辨率下检出的基因数量进行下游的数据分析。基于 ROI 的 ST 本质上也是 NGS 测序，不过在测序之前需要在组织切片上进行显微切割，首先要对同一类的细胞类型或者区域进行精准切割，然后对切割后的微量样本进行微量的 NGS 转录组测序，例如 LCM - seq、DSP 转录组等。这类技术的特点是单个区域或细胞类型的测序深度较高，但不适合从头探索类的研究，而适合与第二类技术关联研究，或者用于结果检测和验证等。![]()
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[1] Wang N, Hong W, Wu Y, et al. Next-generation spatial transcriptomics: unleashing the power to gear up translational oncology. MedComm. 2024; 5:e765.[2] Jin, Y., Zuo, Y., Li, G. et al. Advances in spatial transcriptomics and its applications in cancer research. Mol Cancer 23, 129 (2024).
[3] H.-E. Park, S. H. Jo, R. H. Lee, C. P. Macks, et al. Spatial Transcriptomics: Technical Aspects of Recent Developments and Their Applications in Neuroscience and Cancer Research. Adv. Sci. 2023, 10, 2206939.
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