应用CRISPR基因编辑技术优化CAR-T细胞疗法

本文以文章 Leveraging CRISPR gene editing technology to optimize the efficacy, safety and accessibility of CAR T-cell therapy 为知识框架，总结了CRISPR系统在改善CAR-T疗法临床应用方面的用途，包括优化疗效和安全性，开发通用型CAR-T细胞，并讨论了CRISPR编辑技术面临的挑战及解决方案，为未来研究提供潜在方向。

一、CRISPR编辑系统的机制和优势

锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应核酸酶（TALEN）依靠蛋白质结构域识别目标序列，构建过程繁琐费力，而CRISPR编辑技术将复杂的蛋白质工程问题转变为RNA编码问题，迅速成为基础研究和临床应用极具吸引力的工具。在基本的CRISPR-Cas系统中，如CRISPR-Cas9，Cas核酸酶由sgRNA引导并定向到靶标，切割目标DNA生成双链断裂（DSB），而后通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）等内源性途径修复DSB，实现基因敲除或供体基因写入。

1.1 CAR-T细胞编辑所用的CRISPR工具

1.1.1 Cas9与Cas12a系统

目前，已开发出大量高性能且具有特定功能的CRISPR基因编辑工具，含II型、V型和VI型在内的二类系统获得了最多的关注和应用。属于II型CRISPR系统的Cas9源自化脓性链球菌，是最早用于基因组编辑的工具。系统由Cas9核酸酶和合成的单导向RNA组成，后者通过结合CRISPR RNA（crRNA）与转激活crRNA（tracrRNA）形成。Cas9通过sgRNA识别靶序列，指引Cas9蛋白在NGG（N为A、T、C或G）序列上游的第三个碱基处切割DNA，形成DSB。Cas12a（Cpf1）源自酸氨基球菌，属于V型CRISPR-Cas系统，与Cas9相比，具有多个内在差异。Cas12a能够以松散的方式与靶序列结合，严格检查每个碱基对，切割后产生粘性末端，这将利于CAR转基因的插入。尽管Cas12a的编辑效率低于Cas9，但其具有更低的脱靶率，并能自处理前体crRNA简化编辑过程。

1.1.2 转录和转录后调控

转录起始强度和表观遗传改变可以影响基因表达，导致无法通过简单的插入缺失（indel）形成来控制的表型。为了解决这个问题，已开发出DNA切割缺陷的Cas9（dCas9）用于调控基因转录程序。基于这一发现，dCas分子可以与转录或表观遗传调控因子结合，精确地将治疗性调控域定向到基因组的特定区域，而不会造成DNA损伤或编辑。这种方法还降低了DNA损伤、脱靶编辑和染色体重排的风险。

CRISPR干扰（CRISPRi）和CRISPR激活（CRISPRa）通过结合dCas9与转录调控因子，可精确调控基因表达。CRISPRi通过KRAB抑制转录启动，而CRISPRa通过VP64激活转录。dCas9还可与表观遗传因子结合，进行DNA甲基化和组蛋白修饰的表观基因组编辑。Cas13d是新兴VI型CRISPR系统，能精确靶向和降解mRNA，其干扰效率高达96%，且不受PAM序列限制，具有广阔的编辑范围。基于Cas13d的多重转录调控平台MEGA，能在CAR-T细胞中实现定量、可逆的调控。然而，Cas13d组成性表达的免疫原性可能影响其应用，未来还需进一步评估。

1.1.3 碱基编辑

融合的CRISPR技术已被应用于CAR-T细胞，以实现精准的基因编辑，克服了传统的插入缺失（indel）形成过程中难以控制的突变问题。碱基编辑器（BEs）通过将Cas9单切口酶（nCas9）与脱氨酶结合，实现靶点的精准碱基转换。常见的碱基编辑器包括胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE），分别介导C:G-to-T:A和A:T-to-G:C的转换。新兴糖苷酶碱基编辑系统（CGBE）能够引入多种碱基转换，如C→G、C→T和C→A，而双脱氨酶介导的AGBE系统则可同时进行四种碱基转换。与传统CRISPR-Cas系统相比，BEs能避免由DSB引发的基因组重排和不可预测的编辑结果。尽管如此，BEs可能仍会导致少量indels或转录反应的副作用，因此其在临床应用中的安全性仍需进一步研究。

1.1.4 先导编辑

先导编辑（PE）是一种精准的基因编辑技术，通过结合Prime Editing导向RNA（pegRNA）和Prime Editor蛋白，实现无需DSB或HDR的高效编辑。PE能够精确实现12种类型的突变以及多种碱基的插入和删除。在斑马鱼胚胎细胞中的编辑效率可达到30%，在人类T细胞中的TRAC和B2M基因编辑效率报道超过90%。与碱基编辑或核酸酶介导的DNA序列替换相比，PE在直接重新编辑目标DNA时具有更高的特异性和纯度。此外，像DNA聚合酶编辑器（DPEs）和Click Editing等新兴技术，使用高保真DNA依赖性聚合酶和外源模板，可实现高效且精准的基因写入。

1.2 CRISPR用于CAR-T编辑的独特优势

CRISPR系统在CAR-T细胞编辑中可发挥位点特异性整合（定向整合）和多基因编辑的独特功能。通过DSB的HDR修复途径可将CAR供体模板精确整合到不同的目标基因位点中，如TRAC。定向整合实现了knocking in和knocking out“一石二鸟”的基因编辑效果，更重要的是避免了病毒载体随机整合的致癌风险。由于负责DNA切割的Cas蛋白均为同一形式，因此只需根据靶位点设计相应的gRNA，使Cas酶与各种gRNA在细胞内同时表达，从而达到多基因靶向编辑的目的。

通过电穿孔或脂质颗粒包封，可以将Cas mRNA和gRNA或预形成的核糖核蛋白复合物（RNP）直接递送到细胞内。瞬时表达CRISPR编辑系统具有成本低、off-target概率低、无病毒载体致癌突变风险等诸多优点。

1.3 CRISPR筛选

高通量CRISPR筛选作为一种无偏倚的靶标识别平台，是全面表征CAR-T细胞与肿瘤细胞之间相互作用的强大工具。筛选过程涉及将构建好的sgRNA文库转导入细胞群体，然后根据每个细胞接收到的独有sgRNA进行特定扰动。在应用特定筛选标准后，从基因扰动的细胞群体中选择感兴趣的表型细胞群进行读数和sgRNA测序，即可识别潜在的正向和负向驱动因素。此外，还可将与研究目标相关的已知基因组合在一起，构建多基因crRNA阵列文库，筛选出具有协同基因组合的细胞群体，以获得改进T细胞的优化方案。根据基因扰动策略的不同，CRISPR筛选可分为功能缺失（loss-of-function，LOF）筛选和功能获得（gain-of-function，GOF）筛选。新发现的靶标通过基因敲除或激活可在CAR-T细胞中进行验证，也可直接在CAR-T细胞池中执行CRISPR筛选验证。另外，在表达cas9的肿瘤细胞中，引入sgRNA慢病毒文库并通过标记物表达或CAR-T细胞免疫攻击进行筛选，也可以鉴定肿瘤免疫逃逸机制和CAR-T细胞治疗的耐药基因。

二、CRISPR在CAR-T中的应用

一般来说，CAR-T细胞的制备过程包括从患者体内采集外周血细胞，选择、富集和激活T细胞，转导CAR基因，扩增细胞，最后将其重新输注回患者体内。其中，采用HDR介导的CAR基因靶向整合，能够有效避免传统LV转导CAR基因所带来的致癌风险。为优化CAR-T细胞的疗效和安全性，采用多重基因编辑技术。通过敲除免疫检查点、表观遗传修饰位点以及促进细胞疲劳的基因，解决疗效问题。沉默与细胞因子释放综合征（CRS）相关的基因，并调节靶向外源抗原（如CD7和CD5），疏解安全风险。此外，结合CRISPR筛选技术可以帮助识别不同生物学背景下影响CAR-T细胞疗效的调控机制，以及肿瘤细胞中导致耐药和免疫逃逸的未知机制。

2.1 优化CAR-T细胞的效能

2.1.1 破坏免疫检查点

肿瘤细胞通过多个免疫检查点作用抑制免疫反应，这些检查点阻碍了CAR-T细胞的抗肿瘤攻击。联合免疫检查点抑制剂（ICI）与CAR-T细胞治疗能够阻断抑制通路，显著提高抗肿瘤反应。然而，这种联合治疗可能激活免疫系统，增加自身免疫病的风险。CRISPR系统构建的免疫检查点敲除CAR-T细胞可避免这一问题。常用的策略是敲除PD-1，以增强抗肿瘤效能并减少CAR-T细胞功能性衰竭。此外，PD-1作为理想插入的位点，可以同时执行CAR基因转导与PD-1敲除。CTLA-4、LAG-3和CD70等免疫检查点的敲除也在体内外模型中展示了强大的抗肿瘤作用。新发现的RASA2、CD5和BTLA等基因敲除后，在增强CAR-T细胞信号传导和细胞毒性活性方面表现出重要作用。总之，敲除抑制性检查点有助于进一步释放CAR-T细胞的治疗潜力。

2.1.2 规避肿瘤微环境的免疫抑制

CAR-T细胞的疗效和持久性受到肿瘤微环境（TME）中复杂成分的破坏，包括可溶性因子、免疫抑制性细胞以及细胞外基质的物理屏障。尽管多种药物、抗体和小分子抑制剂能有效绕过TME中的免疫抑制路径，但其副作用和漫长的开发过程限制了临床应用。CRISPR系统为探索这些抑制通路并克服微环境障碍提供了新途径。转化生长因子-β（TGF-β）通过与TGF-β受体II（TGF-βRII）结合，诱导免疫抑制反应。CRISPR-Cas9介导的TGF-βRII敲除已证明能防止CAR-T细胞衰竭并减少Tregs的极化，增强抗肿瘤能力。敲除二酰甘油激酶（DKG）和腺苷受体A2AR的CAR-T细胞，在小鼠肿瘤模型中展现出显著的抗肿瘤效果。此外，自噬相关蛋白ATG5的敲除也显示能提高CAR-T细胞的代谢活性和抗肿瘤能力。

2.1.3 CAR-T细胞的表观遗传调控

表观遗传修饰是CAR-T细胞功能的重要调控路径，也是癌症进展的重要推动因素，深刻影响T细胞的终末分化、增殖能力和效应功能。通过CRISPR基因编辑靶向涉及DNA和组蛋白表观遗传修饰的基因，可稳定重编程T细胞功能。CAR-T细胞在体内的分化能力是影响其持久性的关键因素，未完全分化的CD8+ T细胞表现出更强的抗肿瘤效能。记忆性T细胞（如中枢记忆T细胞和干细胞记忆T细胞）具有更强的效应功能和增殖能力，能在患者体内保持更长的持久性。针对DNA表观遗传修饰，CRISPR可用于敲除与T细胞终末分化相关的表观遗传调控基因，如敲除DNA甲基转移酶3α（DNMT3A）基因，能够抑制关键基因的甲基化，保持CAR-T细胞的记忆和增殖能力，增强其对慢性肿瘤的持续杀伤作用。对于组蛋白修饰，敲除PR域锌指蛋白1（PRDM1）可显著上调多个记忆相关转录因子，并下调多个效应分化诱导基因，从而抑制T细胞的过度激活，保持CAR-T细胞的早期表型，并促进多功能细胞因子的分泌。表观遗传重编程能够调节CAR-T细胞的发育轨迹，表现出防止或逆转T细胞终末分化的潜力。

2.1.4 其他干预途径

随着CAR-T细胞治疗抗性和复发机制的研究深入，多个调控T细胞活性的靶点被发现。炎性细胞因子分泌被认为是抗肿瘤的重要路径，但受Roquin-1和Regnase-1等炎性调节因子抑制。双重敲除Roquin-1和Regnase-1，CAR-T细胞可发挥增强的抗肿瘤效能。重复抗原刺激可过度激活CAR-T细胞，触发Fas介导的细胞死亡，敲除之可延长细胞持久性。此外，CRISPR系统敲除转录因子IKZF3可增强CAR-T细胞细胞因子分泌，提升疗效。代谢异常也是CAR-T细胞衰竭的重要因素，通过靶向PI3K/Akt信号通路，增强细胞的OXPHOS代谢，也能显著提高CAR-T细胞效能。

2.1.5 CRISPR筛选挖掘新靶点

CRISPR筛选揭示了许多调控CAR-T细胞抗肿瘤活性的潜在靶点，包括RASA2、SOCS1、ST3GAL1等负调控因子，它们在肿瘤免疫逃逸和细胞功能受损方面产生不良影响。通过CRISPR系统敲除上述基因，可有效增强CAR-T细胞的增殖、迁移能力和抗肿瘤效能。基于GOF激活筛选发现，PRODH2基因过表达可重新编程脯氨酸代谢增强线粒体增殖和氧化磷酸化，提升CAR-T细胞的细胞毒性。使用BE进行LOF和GOF变异的单核苷酸高分辨率筛选，可以识别调节 T 细胞活化和细胞因子产生等功能的变异。将鉴定的PIK3CD GOF突变用以改造CD19 CAR-T细胞，可赋予细胞持续增强的信号传导和效应功能。CRISPR筛选还可以探讨肿瘤细胞对CAR-T细胞的抗性机制，如敲除CD58或GPI锚定，发现肿瘤细胞表面抗原的表达改变，逃脱CAR-T细胞识别。此外，CRISPR 筛选还能阐明药物与 CAR-T 细胞联合使用时的作用机制，了解药物的调控功能有助于确定免疫治疗过程中联合药物的优先顺序，进一步释放抗肿瘤的潜力。

2.2 规避CAR-T疗法的不良事件

2.2.1 缓解CRS和ICANS

尽管CAR-T细胞显示出惊喜的疗效，但其相关的不良反应，特别是细胞因子释放综合症（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合症（ICANS），仍掣肘了CAR-T疗法的临床应用。CRS是一种全身性炎症反应，而ICANS表现为神经系统症状。目前的治疗策略，如高剂量类固醇和托珠单抗，效果有限，特别是在治疗神经毒性方面。GM-CSF与CRS和ICANS密切相关，通过CRISPR系统敲除GM-CSF可以有效减少这些毒性反应。此外，CRISPR敲除CD40L和CSF2可减少旁观单核细胞分泌的IL-6，进一步降低毒性。结合GM-CSF敲除与IL-6和IL-1拮抗剂共同表达的策略，在临床试验中已表现出毒性下降且抗肿瘤活性维持的结果。

2.2.2 解决靶向非肿瘤细胞（on-target off-tumor）毒性

CAR-T细胞理想的靶标蛋白分子应在肿瘤细胞表面高特异性、高稳定性地表达。然而，许多CAR-T细胞靶点抗原在正常细胞也有表达，导致OTOT毒性。针对这种情况，利用CRISPR系统在CAR-T细胞或造血干细胞中进行编辑，可有效减少同类杀伤和造血毒性。例如，通过敲除CD7和CD5，CAR-T细胞可避免CD7/5靶向的细胞间自相残杀。CD33和CD45靶向的CAR-T细胞面临类似问题，但通过基因编辑可在保护正常细胞功能的同时，增强治疗效果。

三、CRISPR系统构建通用型CAR-T细胞

自体T细胞质量参差不齐、制造工艺复杂、生产周期长以及成本高昂，为临床应用带来诸多挑战。通用型CAR-T细胞（UCAR-T），也被称为“现货型”CAR-T细胞，产品来自健康供体，制备期间可能经历多个基因编辑过程，当前正被广泛研究和开发用于大规模生产。UCAR-T产品有望克服自体CAR-T细胞的相关问题，在安全性、疗效和可负担性方面实现可及。

3.1 克服UCAR-T细胞疗法的挑战

相对CAR-T细胞，UCAR-T细胞的主要区别在于其供体来源为健康供体衍生的同种异体T细胞，而非自体T细胞。这要求UCAR-T细胞在临床应用中解决免疫排斥的挑战。首先是安全性，由于同种异体CAR T细胞攻击宿主组织可能导致危及生命的移植物抗宿主病（GVHD），敲除内源性αβ TCR可预防GVHD。其次是疗效，因为同种异体CAR-T细胞可能被宿主免疫系统清除，导致宿主抗移植物排斥反应（HVGR），敲除HLA I类和II类分子以预防HVGR（分别通过删除B2M/HLA-A、B和CIITA）。实现持久性的其他方式：敲除CD52（可使细胞在alemtuzumab清淋的情况下持续存在），敲除NK细胞激活剂脊髓灰质炎病毒受体（PVR），添加NK细胞抑制剂（如HLA-E、HLA-G、CD47和CD300a TASR）来抵抗NK细胞攻击。破坏PD-1等分子也可增强UCAR-T细胞抵抗免疫抑制的能力。

3.2 拓展UCAR-T细胞来源

UCAR-T细胞通常取自健康供体的T细胞，但外周血T细胞的扩增能力有限，难以满足大规模生产的数量需求。有赖于优异的扩增能力和对多基因编辑的耐受性，诱导性多能干细胞（iPSCs）或是构建UCAR-T细胞的合适来源。iPSCs通过重编程供体T细胞恢复多能性，继而经基因编辑生成CAR-iPSCs，随后被诱导分化为CAR-T细胞用于临床。CAR-iPSCs具有自我更新能力，选择最优的工程化细胞系进行规模生产。可有效提高不同批次之间的同质性和治疗效果，并有望进一步降低成本。

3.3 通用型CAR-T的临床试验

经CRISPR系统编辑的UCAR-T相关临床试验正在广泛展开。这些试验大多集中在各种血液系统的恶性肿瘤中，而对实体瘤的研究进展仍处于早期阶段。应用最广泛的UCAR-T疗法仍是针对B细胞恶性肿瘤的CD19靶向治疗，目前已有近20款CRISPR编辑生产的产品开启了临床研究。针对B细胞或T细胞系白血病的UCAR-T疗法疗效最佳，其完全缓解（CR）或完全缓解伴不完全计数恢复（CRi）的比例在60%-85%之间。除零星的病例存在低等级的GVHD外，绝大部分试验都未观察到GVHD。而CRS等不良事件比较常见，但经单抗治疗后都能实现有效的副作用管理。总体而言，经CRISPR系统编辑的UCAR-T细胞在预防GVHD方面表现出令人鼓舞的安全性，在血液恶性肿瘤中表现出有效的抗肿瘤活性，但整体上仍达不到自体CAR-T细胞疗法的疗效。值得注意的是，供体来源的T细胞具有更强的耐受性，可以进行多重基因编辑。这为探索更多旨在提高细胞持久性和疗效的基因改造提供了机会。

四、CRISPR在CAR-T中应用的挑战及解决策略

4.1 不良事件

4.1.1 脱靶效应

尽管CRISPR基因编辑系统在CAR-T免疫疗法中展现了巨大的潜力，但也带来了额外的遗传毒性风险。由于基因组的相似性，Cas蛋白可能在非靶基因位点引起脱靶的DSBs，导致非预期突变，称为脱靶效应。这可能引起非靶基因功能或调控的不可预测改变。研究发现，使用CRISPR系统编辑TRAC、TRBC和PD-1时，出现多个脱靶突变。尽管没有观察到细胞的致癌转化，但脱靶突变随机发生，可能破坏肿瘤抑制基因、抗肿瘤活性相关基因或生存必须基因，对CAR-T细胞的质量造成不利影响。因此，必须采取措施提高靶向特异性，最小化脱靶风险。

使用高保真工程核酸酶可提高 DNA 切割的准确性。应用二聚体系统，如Cas-CLOVER，结合两个gRNA和dCas9，也可提高DNA切割的特异性和准确性。此外，改进sgRNA序列、降低核酸酶浓度及瞬时转导核酸酶也是有效的降低脱靶效应的方法。未来，人工智能的应用可能帮助更准确地预测基因编辑的靶向与脱靶效应，进一步提升细胞疗法的安全性。

4.1.2 染色体畸变

CRISPR基因编辑系统引发的DSBs可能导致染色体异常，包括大片段缺失、倒位和易位。研究发现，通过CRISPR筛选和单细胞分析，55%的gRNA编辑会引发染色体丢失。在UCAR-T细胞生产中，TRAC基因敲除是常见方案，但常导致染色体异常。研究发现，人类初级T细胞中TRAC位点的CRISPR编辑可引起14号染色体的大范围缺失，影响基因表达，激活p53相关的DNA损伤反应，导致细胞周期停滞并削弱CAR-T细胞的生存优势。

CRISPR系统编辑过程中产生的DSB是染色体畸变的关键驱动因素 。使用BE可以精确地进行单碱基替换，避免双链断裂，减少基因重排的风险。另一种方法，PASSIGE系统，结合了Bxb1整合酶和PE技术，也无需产生DSBs，即可精准替换多个DNA片段，编辑效率超过60%，检测未发现脱靶效应和染色体易位。然而，上述方案将造成永久 DNA 编辑，无法完全消除与之相关的安全风险，转录与转录后水平调控的 CRISPRi 与 Cas13d 显示出独到的应用潜力。

4.2 CRISPR组件递送

递送是应用基因编辑技术的难题。尽管传统的病毒载体递送CRISPR组件具有较高效率，但其载荷容量有限，且存在安全风险，因此难以满足CAR-T细胞生产的高质量和低成本要求。此外，相较于体外方法，体内递送在简便性、成本效益和临床应用方面具有优势，但依然面临显著的挑战，如载荷降解、内吞后无法释放载荷以及脱靶细胞的摄取和编辑。

电穿孔是最常见的非病毒递送方法，具有成本效益和操作简便等优点，且将CRISPR组件（如RNA或RNP）引入T细胞时不受载荷形式和大小限制。但电穿孔的缺点之一是造成细胞膜穿孔，这可能导致细胞死亡。因而需要严格控制电流大小以减少损伤。通过抑制半胱天冬酶-3的表达，也能够缓解电穿孔引发的CAR-T细胞凋亡。另外，使用电穿孔递送线性双链DNA（dsDNA）模板时，DNA毒性可能显著降低T细胞活性。为解决此问题，可以通过调整渗透压、共电穿孔RNP和dsDNA或单链DNA（ssDNA）模板。此外，细胞穿透肽（CPPs）如TAT、HA2等，可促进基因编辑组件进入细胞，增强编辑效率并降低细胞毒性。

新型合成载体如脂质纳米颗粒（LNPs）为CRISPR系统的体内递送提供了可能。LNPs能够封装RNA形式的CRISPR组件，通过内吞进入细胞，造成的细胞损伤较小。一项研究以此实现了TCR和CD52的双重敲除，成功生成高性能的UCAR-T细胞。此外，病毒样颗粒（VLPs）提供了体内递送的新选择，通过特定的抗原-抗体相互作用，能够实现靶向运输并避免对旁观者细胞的脱靶递送。