心血管疾病中的巨噬细胞：临床意义

六、临床前巨噬细胞靶向策略的现状

（1）靶向趋化因子/趋化因子受体：在动脉粥样硬化中，单核细胞的招募主要是由CCL2-CCR2轴介导。当CCL2或CCR2缺乏时，小鼠的巨噬细胞募集到血管壁减少，并且随后动脉粥样硬化病变大小也减少。相反，若CCL-2过表达，小鼠动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞数量和氧化脂质积聚会显著增加，从而促进动脉粥样硬化的进展。而在心梗中，最近的许多临床前研究也集中在靶向CCL2-CCR2轴上。

• CCL2、CX3CR1和CCR5的联合缺失与单独缺失相比，显著降低了巨噬细胞的浸润，并减少了斑块的病变大小。

• CCR2和CX3CL1的联合缺失也显著减少了病变中巨噬细胞的积累，降低了动脉粥样硬化斑块的不稳定性。这些结果表明同时靶向多种趋化因子或受体是一个有潜力的治疗策略。

• 对动脉粥样硬化小鼠使用巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）抗体治疗可大大降低病变中的巨噬细胞含量，并导致循环和局部主动脉炎症介质的水平显著降低，进而促使斑块发展面积减少。

• 通过CCR2抑制剂来减少CCR2的表达可显著减少心脏中单核细胞募集，以缓解炎症级联反应并减少心肌梗死面积。

（2）靶向粘附分子：对于单核细胞的粘附，这一过程主要由血管内皮细胞上的VCAM-1和循环单核细胞上的VLA-4整合素之间的结合作用介导。

• 直接抑制VCAM-1已被证明可以阻止单核细胞浸润到内皮下空间，从而有效阻止动脉粥样硬化病变形成所需的巨噬细胞成熟和泡沫细胞转化。

• 选择性抑制VCAM-1/VLA-4相互作用的高特异性肽和抗体治疗药物最近成为一种有希望的基于粘附的抗动脉粥样硬化治疗方法。

• 在渗出过程中，连接粘附分子A（JAM-A）的抑制也可以有效抑制炎症和动脉粥样硬化内皮的单核细胞募集，进而减少动脉粥样硬化的形成。

通过靶向巨噬细胞对胆固醇摄取、酯化和外排中的关键蛋白来抑制泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化治疗的重要策略之一。

• 通过单独沉默SR-A，可以显著减少泡沫细胞形成，从而减少动脉粥样硬化的发生

• 胆固醇酯化过程中的ACAT-1在动脉粥样硬化中的作用目前尚有争议。有研究发现ACAT-1的药理学抑制会导致动脉粥样硬化小鼠和兔子模型中泡沫细胞形成的增加，进而促进了斑块的形成。而其过表达也会促进胆固醇酯CE积累和巨噬细胞衍生的泡沫细胞形成，增加了动脉粥样硬化的发生。

• 对LDL受体缺乏的小鼠使用PPARα和PPARγ激动剂治疗后，诱导了LXRα和LXR介导的ABCA1表达，进而促进了胆固醇外流，并减少了泡沫细胞形成，从而抑制了动脉粥样硬化的发展

巨噬细胞的死亡方式主要分为细胞凋亡、调节性坏死（包括坏死性凋亡、焦亡和铁死亡）和自噬。目前靶向这些死亡方式以调节巨噬细胞存活的治疗策略主要集中在动脉粥样硬化疾病上，在心脏领域对巨噬细胞死亡方式关注较少。

（1）诱导细胞凋亡：细胞凋亡是一种有序的细胞死亡方式，可以清除多余或损伤的细胞，避免炎症反应。

• 通过氯膦酸盐脂质体（Clo-Lip）给药，可以抑制线粒体耗氧量，从而导致巨噬细胞凋亡，并阻止了动脉粥样硬化的进展。

• 重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）全身用于糖尿病诱导动脉粥样硬化的小鼠时，诱导了动脉粥样硬化斑块中浸润巨噬细胞的凋亡，但不诱导循环巨噬细胞的凋亡，并显著减弱动脉粥样硬化的发展。

（2）靶向巨噬细胞调节性坏死（包括坏死性凋亡、焦亡和铁死亡）：与细胞凋亡相反的是，调节性坏死诱导炎症反应。

• 靶向巨噬细胞坏死性凋亡：对动脉粥样硬化病变的小鼠使用坏死性凋亡的药理学抑制剂坏死抑素-1（Nec-1）进行干预，发现可以防止病变进一步进展并减少斑块不稳定的标志物（即坏死核心和坏死性细胞死亡）。

• 靶向巨噬细胞焦亡：细胞焦亡过程中的NLRP3炎症小体的激活是动脉粥样硬化形成中所必需的，因此靶向破坏NLRP3炎症小体能够显著保护动脉粥样硬化小鼠免受疾病侵袭，并减少病变大小。

• 靶向巨噬细胞铁死亡：研究发现使用Micheliolide （MCL）或IL-37，可以激活核因子红系相关因子2（NRF2）通路，进而抑制巨噬细胞铁死亡，并减轻动脉粥样硬化进展。

（3）靶向自噬：自噬是一种非凋亡性细胞死亡形式，能够避免炎症反应。

• 通过靶向自噬通路激活的关键蛋白mTOR，比如使用mTOR抑制剂（如依维莫司）或小干扰RNA沉默mTOR，可以诱导巨噬细胞自噬基因的激活，从而导致斑块中巨噬细胞的清除，促进稳定的斑块表型。

巨噬细胞在心血管系统中具有调节炎症和纤维化、脂质代谢、胞葬等多种功能，对巨噬细胞的功能进行调节是治疗心血管疾病的一种思路。值得注意的是，目前大多心血管疾病中巨噬细胞功能调控的研究缺少在不同时间点施加干预所得结果之间的对比，未来需要加强对最佳干预时间窗口的探究。

（1）针对心脏系统：目前主要基于缺血性损伤模型探究细胞因子（IL-1、IL-4以及IL-10）和细胞疗法（间充质干细胞（MSCs）和体外重编程巨噬细胞）对于巨噬细胞功能的调控。

• 抗IL-1β抗体或anakinra（一种外源性重组人IL-1Ra）治疗通过抑制IL-1发挥减弱炎症强度、阻止白细胞过度聚集、抑制心肌细胞凋亡等功能。

• IL-4和IL-10在炎症期全身输注或靶向递送能够诱导巨噬细胞产生具有抗炎、促血管生成、促进胶原生成等功能的修复期生物活性介质。

• 输注Cardiac Nestin+ MSCs、体外M-CSF和IL-4联合处理的巨噬细胞，或缺氧诱导的体外重编程巨噬细胞进入MI动物模型中，观察到心脏梗死区或远端病理性纤维化减弱，微血管形成增强、心肌细胞肥大减弱等现象。

（2）针对血管系统：主要基于AS模型探究表观遗传（主要集中在在microRNA，如miR-21,miR-155miR-33和miR-144-3p）和细胞因子（IL-1、IL-19和IL-13等）调控巨噬细胞的功能。

• 在AS晚期，将miR-21局部递送至颈动脉斑块中或广泛抑制miR-155表达可抑制巨噬细胞分泌TNF-α、MCP1、IL-6以及IL-1β等炎症介质，而促进IL-10的表达。可减轻AS斑块负荷，防止斑块破裂，延缓AS的进展。

• 抗miR-33和miR-144-3p疗法促进ABCA1和ABCG1介导的巨噬细胞内胆固醇的外排，减轻脂质积累和炎症反应。

• IL-19和IL-13给药可激活STAT3、STAT6、KLF4等通路来促进巨噬细胞发挥抗炎、外排脂质、胞葬等功能。

• 抗IL-1β抗体可抑制IL-1介导的慢性炎症和脂质代谢障碍，进而改善动脉粥样硬化斑块稳定性。

（3）临床药物：许多已经得到临床应用的降糖降脂药物也被发现能够调节巨噬细胞功能，比如达格列净、吡格列酮、西格列汀以及瑞舒伐他汀等。

• 达格列净是一种高效和选择性的钠-葡萄糖共转运体2(SGLT2)抑制剂，已被证明可以减轻纤维化和AS的形成。在调控纤维化方面，达格列净通过抑制巨噬细胞炎症通路（尤其是NF-κB）以及促进RONS/ stat3途径介导的修复功能有效减轻心梗后心肌纤维化。此外，其还可以通过抑制巨噬细胞中 LPS 诱导的 TLR-4 过表达和 NF-KB 的活化，从而促进M1巨噬细胞向M2表型转化,降低动脉粥样硬化斑块形成的速度并增加斑块稳定性。

• 吡格列酮是一种PPAR-γ激动剂，MI后静脉注射给药通过抑制NF-κB使巨噬细胞向促愈合的M2型倾斜，减少了梗死区和边界区纤维化。

• 西格列汀通过SDF-1/CXCR1信号转导促进巨噬细胞向 M2 表型偏转，而瑞舒伐他汀通过提高巨噬细胞中ABCA1、ABCG1、Arg-1、CD206的表达促进了胆固醇外排和抗炎介质的分泌，它们的使用可以减弱早期动AS病变的形成，减轻AS斑块负荷，阻止AS进一步发展。

七、临床进展及转化潜能

目前大多数关于心血管疾病的临床试验是基于炎症细胞因子和趋化因子（如IL-1、IL-6、TNF-α、CCL2）的抗炎疗法和抑制泡沫细胞生成的抗脂疗法。

（1）靶向炎性细胞因子：

• CANTOS试验是首个成功的CVD免疫治疗试验。一种针对IL-1β(一种主要由巨噬细胞产生的炎症细胞因子)的中和抗体canakinumab，是首个在临床试验中显示特异性并成功降低心肌梗死患者炎症和心血管事件复发率的药物。

• 秋水仙碱，一种广泛抗炎的药物，不仅也可以抑制巨噬细胞中NLRP3炎症小体激活的IL-1β产生，还可以干扰TNF-α诱导的核因子κΒ（NF-κΒ）通路来减轻炎症。COLCOT试验（秋水仙碱心血管结果试验）表明，心梗患者进行秋水仙碱治疗后显著降低了复苏性心脏骤停、心肌梗死、中风和心绞痛等缺血性心血管事件的风险。LoDoCo2试验（用于心血管疾病二级预防的低剂量秋水仙碱）也表明，每日服用一次0.5mg秋水仙碱可显著降低慢性冠状动脉疾病患者发生心血管事件的风险。

• IL-6作为 IL-1的下游炎症信号，同样参与炎症反应和免疫调节进而影响心血管疾病的发生发展。ASSAIL-MI试验表明，tocilizumab（IL-6抗体）的早期治疗增强了急性STEMI患者的心肌挽救，并且患者心肌梗死面积有缩小的趋势。

（2）靶向趋化因子和趋化因子受体：

• 已有两项针对抑制CCL2-CCR2轴的II期临床试验成功进行。对经皮冠状动脉介入治疗后的患者给予Bindarit（CCL2抑制剂）治疗可以预防再狭窄。此外，对有CVD危险因素的患者进行抗CCR2单克隆抗体MLN1202治疗可以显著降低其冠状动脉疾病相关炎症的既定生物标志物C反应蛋白（CRP）水平。

（3）抗脂疗法：

• 研究表明全身ACAT抑制也可降低高胆固醇血症受试者的循环TNF-α水平并改善血管内皮功能，说明这可能是一种针对动脉粥样硬化中血管炎症和内皮功能障碍的新治疗策略。然而，随后的几项试验通过对高胆固醇血症患者、冠状动脉粥样硬化患者进行ACAT抑制却发现并不能改善病变，反而会促进动脉粥样硬化的形成。这可能是因为抑制ACAT-1会导致巨噬细胞内游离胆固醇积累到毒性水平，导致细胞死亡。因此，将靶向ACAT作为心血管疾病的治疗策略可能需时需要谨慎考虑其多方面的作用。

对于目前正在进行的临床试验，主要以抗炎疗法为主，包括广泛的免疫抑制以及靶向特定细胞因子的抗炎疗法。

（1）广泛免疫抑制：

• 秋水仙碱的应用最为广泛，正在急性冠脉综合征患者（NCT01906749、NCT00754819）、冠心病患者（NCT05130892）、心梗患者（NCT03048825）和缺血性脑卒中或短暂性脑缺血发作高危患者（NCT02898610）中进行治疗测试，评估其治疗后主要心血管不良事件（MACE）（MI、死亡、因不稳定型心绞痛和心力衰竭住院）的发生率。

• 羟基氯喹和甲氨蝶呤，原本是一种抗风湿的广泛抗炎药物，均被发现可显著降低类风湿性关节炎患者的心血管疾病风险。目前有两项在心梗患者（NCT02648464）和冠心病患者（NCT02874287）中使用羟基氯喹治疗的临床试验正在进行，以MACE发生率为主要终点。还有一项对冠心病患者使用LDL样纳米颗粒递送甲氨蝶呤的临床试验正在进行（NCT04616872）。

（2） 靶向细胞因子及细胞因子受体：

• 针对IL-6，目前有对类风湿性关节炎且高CRP水平的患者使用抗IL-6受体单克隆抗体Sarilumab（NCT04350216）以及对慢性肾脏病且高CRP水平的患者使用抗IL-6单克隆抗体Ziltivekimab（NCT05021835）的临床试验正在进行，分别以动脉粥样硬化斑块的改变以及MACE发生率为主要终点。

• 对于促炎细胞因子TNF-α，目前也有TNF-α的抑制剂Etanercept在急性ST段抬高型心肌梗死的患者中进行临床测试（NCT01372930）。而在使用抗脂疗法方面，一项对有既往MI史患者使用抗LOX1受体抗体MEDI6570的临床试验正在进行，并以其非钙化斑块体积作为主要的终点（NCT04610892）。

就心血管疾病的临床前治疗方式如何向临床进一步转化而言，纳米材料与细胞治疗是两项有前景的转换策略。

（1）纳米材料：细胞因子、趋化因子、microRNA等生物分子的空间结构在生物体内会受到生物酶、温度、酸碱度以及周围环境的离子强度等生物、物理和化学因素的影响，并且还面临着脱靶、难以突破生物膜屏障等问题，这在一定程度上阻碍了药效。基于纳米材料的装载能力和可修饰性等特性，纳米材料可以实现对生物分子进行封装递送以隔离体内环境，将其本身与生物分子或残基组装以减轻脱靶效应，以及采用脂溶性或具有正表面电位的材料来源以帮助治疗药物跨越细胞膜等，这为解决药物临床转化的障碍提供了解决思路。

（2）细胞治疗：细胞治疗具有个体化、持久性、低耐药性等优势，能够解决传统药物无法解决的难治性心血管疾病。在制备体外重编程巨噬细胞细胞以进行过继移植治疗时，自体来源巨噬细胞不仅在采集和处理过程中效率较低，更重要的是，巨噬细胞本身较弱的增殖特性和较难的基因操作特性加大了在体外对其进行修饰和扩充的难度。而以健康供体的诱导多能干细胞（iPSC）为源头，利用其良好的可塑性和增殖性可大量制备修复性巨噬细胞，将大大提高基于巨噬细胞的细胞疗法治疗效率。间充质干细胞（MSCs）移植有助于心血管疾病的治疗，然而，基于MSCs的细胞疗法可能会引起生物体许多不良反应，例如免疫反应、栓塞、移植物抗宿主病和恶性肿瘤风险。分泌外泌体是MSCs发挥功能的主要方式，输注外泌体或进一步分离外泌体中的效应物质可以最大限度地减少活细胞管理的安全性问题，表现出降低的免疫原性和肿瘤发展风险。值得注意的是，已经有很多纳米材料和细胞治疗运用于临床各个领域，这为心血管领域的临床转化提供了先例。