核酸适配体是对靶标分子有特异性结合能力的单链DNA或者RNA分子，在生物传感器、靶向药物递送、分离以及纳米技术等领域中有很好的应用前景。其中，DNA适配体因其出色的稳定性、低成本、易于修饰及结构可控等特点，成为研究的重点对象。DNA适配体的分离通常采用指数富集配体系统进化（SELEX）方法。适配体与其靶标的结合亲和力通常通过解离常数（Kd）来表征。不同类型的靶标需采用不同的结合测量方法。例如，表面等离子体共振光谱（SPR）常用于蛋白质结合适配体的测定，流式细胞术则多用于细胞结合适配体的研究。对于小分子结合适配体，其测量方法具有更大的灵活性。
加拿大滑铁卢大学刘珏文教授团队综述了用于测量结合小分子靶标适配体Kd值的主要方法，并对部分不推荐的方法进行了说明。Kd值的测定是适配体质量控制的关键环节之一。作者指出，Kd测量中的方法错误是导致许多无实际结合能力的适配体被错误报道的主要原因之一。
作者首先介绍了Kd计算的基本原理。对于适配体A和靶标分子T结合生产AT复合物的反应，其常用的Kd计算公式为：
其中，F是结合了靶标的适配体的比例。这是一个近似的公式，为使得其成立，有几个前提条件，其中重要的一个条件是适配体浓度[A]应大大低于Kd值。如果 [A] >> Kd，那么实测的 Kd= 1/2[A]，则该体系处于“滴定区间”（titration regime）,不能用这个简化的公式。此外，作者还讨论说平衡时间的影响，强调测量应该在体系达到平衡以后进行。在随后的内容中，作者从实用的角度介绍了几种常用的测量Kd的方法。
等温滴定量热法（ITC）：ITC是适配体Kd测量的金标准方法。通过将目标分子逐渐滴定到适配体溶液中，测量释放或吸收的热量，并与参考池的热量变化进行比较，可以获得热力学常数（如Kd）等重要参数。对于Kd相对较差的适配体，所需的适配体也需要使用较高的浓度。比如乳酸适配体由于其结合亲和力低，作者不得不使用 300 μM 的适配体浓度。为了提高可重复性，作者建议在每次实验前对适配体进行退火处理。ITC主要用于验证结合和获得热力学数据，而系统地研究适配体与目标结合的影响因素（如盐、pH值、突变等）通常使用其他方法。
无标记染料法：通过使用DNA荧光染料来研究适配体。这种染料在没有DNA时是没有荧光的，但能与适配体非特异性结合并增强荧光信号。而靶分子结合后则可能会释放染料，从而降低荧光。这种方法便捷快速，不需要修改适配体。作者用R10G2适配体与鸟嘌呤举例说明，测得Kd为0.2 µM，而删除A35后的突变体，荧光变化很小，且Kd增至322.1 µM。这个点突变对照，确保了荧光变化来源于适配体与靶分子的特异性结合。各种染料中，作者发现ThT表现最好，特别是对于非G四链结构的适配体，得到的Kd更接近真实值。ThT染料带正电，容易与负电荷表面（如微孔板和比色皿）发生非特异性吸附。在实验中，使用石英比色皿可减少染料的干扰。使用染料法测定的是表观Kd，可能与真实的Kd有差异。因为染料可能与适配体发生竞争性结合。若染料与适配体的相互作用较弱，则表观Kd会接近真实Kd。
图2.A）R10G2 适配体和突变体的二级结构。B）用 ThT 荧光测定 R10G2 适配体和突变体与鸟嘌呤结合。C） 通过 ThT 和ITC 测定Kd的比较。每个符号代表一个不同的适配体。
链置换反应法：与前面介绍的两种方法不同，链置换反应需要共价荧光标记，通过荧光探针修饰的适配体和和猝灭探针的杂交来监测适配体与目标结合的反应。通常一个短链猝灭探针（quencher-cDNA）与带荧光标记的适配体（如Lac201）结合后，会使荧光信号被猝灭。当适配体结合目标分子后，猝灭探针被置换出去，荧光信号恢复（图3A）。通过对荧光信号随不同浓度的乳酸变化的反应动力学（图3B）进行监测，可以绘制出标定曲线（图3C）。通过滴定猝灭探针并测量荧光变化，可以计算表观Kd。进一步分析适配体与quencher-cDNA结合反应的Kd值，可以得到适配体的真实Kd值。
图3. A） 荧光团标记的适配体和淬灭基团标记的 cDNA 杂交导致淬灭荧光。与靶标分子L-乳酸根结合后，荧光增强。B） 在不同浓度靶标分子下荧光相应动力学。C） 传感器对 L-和 D-乳酸根的标准曲线。D） FAM 标记的适配体在不同浓度的淬灭基团链滴定的荧光变化。
此外，尽管还有许多其他方法，由于篇幅限制，这里不再一一详述。作者特别指出了一些不推荐的方法，例如金纳米颗粒（AuNP）比色法和氧化石墨烯吸附法。总体而言，作者更倾向于均相测量方法，并不建议使用固定小分子靶标分子的异相测量方法。最后，作者强调了实验中控制措施的重要性。无论选择何种适配体Kd测定方法，适当的控制措施都是成功的关键，尤其在仪器设置、DNA质量、靶标浓度以及缓冲液条件等方面需特别注意。即使采用的测量方法本身是可靠的，这些外部因素的不当处理也可能导致测量结果出现偏差。
非结合性适配体突变体是一种非常有效的对照。通过突变适配体的保守区域，可在保持其二级结构和碱基组成基本不变的同时，破坏其结合能力。如果某种测量方法在测试不同突变体时始终得到类似的Kd值，则说明该方法可能存在问题或无效。
论文信息：
Dissociation Constant (Kd) Measurement for Small-Molecule Binding Aptamers: Homogeneous Assay Methods and Critical Evaluations
Stefen Stangherlin, Yuzhe Ding, Juewen Liu*
Small Methods
DOI: 10.1002/smtd.202401572
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