热度不减的cGAS-STING信号通路？结合线粒体自噬登上“巨型顶刊”Nat Commun！绝佳思路上发大分！

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今天大海哥给大家带来的这篇文章于2024年1月发表在Nature Communications杂志上，题为”Mitophagy curtails cytosolic mtDNA-dependent activation of cGAS/STING inflammation during aging”。在这篇文献中，研究人员对小鼠年龄相关的线粒体自噬变化进行系统和系统的分析，研究线粒体自噬与mtDNA引发的炎症之间的相互作用，并探索线粒体自噬促进策略缓解年龄相关生理衰退的潜力。通过转录组分析确定老年小鼠视网膜中cGAS/STING通路的激活并在小鼠模型和人类细胞中进行验证。全文不仅思路完整，逻辑清晰，还包含cGAS/STING通路和线粒体自噬两大国自然热点，如果你也想通过“干湿结合”开展研究，申报课题，欢迎来找大海哥，大海哥这里有超多个性化思路以及专业的生信分析团队为你服务。

题目：在衰老过程中，线粒体自噬减少细胞内mtDNA依赖性的cGAS/STING炎症激活

杂志：Nature Communications

影响因子：IF=14.7

发表时间：2024年1月

研究背景

自噬是维持体内平衡的主要细胞内循环机制之一。线粒体自噬被定义为通过自噬机制去除有缺陷或多余的线粒体，可通过PTEN诱导的激酶1(PINK1)/Parkin途径、线粒体自噬受体或线粒体脂质组成的变化介导。

巨噬细胞功能退化被认为是衰老过程的标志。随着生物体年龄的增长，生物组织中需要降解大量的衰老细胞碎片，以缓解溢出的细胞内容物造成的组织损伤，因此自噬水平的调控与衰老具有一定的相关性。。在本研究中，研究人员对小鼠年龄相关的线粒体自噬变化进行系统分析，研究线粒体自噬与mtDNA引发的炎症之间的相互作用，并探索线粒体自噬促进策略缓解年龄相关生理衰退的潜力。    

研究思路

研究人员首先在使用mito-QC报告鼠分析多个器官中的线粒体自噬时发现，老年鼠与年轻鼠相比，线粒体自噬要么增加要么不变。基于这一现象，研究人员接下来通过转录组分析老年鼠的视网膜中I型干扰素和cGAS/STING的关系。最后，研究人员利用线粒体自噬诱导剂尿素A(UA)进行干预去研究线粒体自噬的药理激活作用。

以下是研究人员的研究思路:

研究结果

1.线粒体自噬水平在生理衰老过程中增加或保持稳定

研究人员构建mito-QC报告基因的小鼠来评估线粒体自噬，该基因普遍表达一种由PH不敏感的mCherry组成的嵌合蛋白，PH敏感性GFP，以及线粒体裂变1蛋白(FIS1)的线粒体靶向序列(MTS)(图1a)。对年轻和老年小鼠的肾脏、大脑、视网膜色素上皮（RPE）、神经视网膜、小脑、肝脏等组织样本进行共聚焦显微镜分析并通过图像分析软件量化mCherry+GFP-的点（代表线粒体自噬体）的数量。结果显示，老年小鼠的肾脏、大脑、视网膜色素上皮、神经视网膜、小脑和肝脏的线粒体自噬水平明显较高(图1b)，胰腺、脾脏、肌肉、心脏和肺部的线粒体自噬水平在两组之间没有差异(图1b)。在分析的大多数器官中观察到PINK1诱导的泛素Ser65位点磷酸化增加(图1c-d)，表明年龄相关的线粒体自噬增加是由响应线粒体膜电位扰动的PINK1/Parkin途径驱动的。    

图1 小鼠的生理性衰老与多器官有丝分裂的稳定或增加有关。

2.游离胞质mtDNA触发cGAS/STING介导的I型干扰素反应和炎症老年小鼠。

视网膜是所有器官中线粒体自噬随年龄增长最明显的区域之一，因此研究人员对年轻和年老小鼠的视网膜进行转录组学分析。老年小鼠的视网膜显示出与炎症和对病毒或内源性细胞质DNA的反应有关的几种途径的上调(图2a)。事实上，前三个正向富集的标志是干扰素应答(IFN-γIFN-α、IFN-γ）和TNF-α信号(图2b)。使用干扰素进行更精细的分析显示，67.5%的显著上调的差异表达基因(DEG)与干扰素刺激基因(ISG)相对应，并且都参与I型干扰素应答(图2c)。考虑到视网膜的免疫特权性质，以及本研究中所有小鼠都接受严格的兽医监测，所以研究人员假设内源性细胞质DNA可能引发这种炎症反应。年轻和老年视网膜的抗DNA免疫染色显示，老年组的胞质DNA数量增加，其中大部分位于富含线粒体的区域(图2d)。使用视网膜样本的亚细胞分离进一步探索老年小鼠细胞质DNA的增加，揭示老年小鼠细胞质部分中完整mtDNA水平显著增加10倍(图2e)。干扰素基因环GMP-AMP合成酶刺激因子(cGAS/STING)轴已被确定为mtDNA释放引发炎症的主要传感器和下游效应物之一。与转录数据一致，研究人员观察到cGAS和STING蛋白水平的显著增加(图2f)，导致下游转录因子干扰素调节因子3(IRF3)的激活，这反映在磷酸化IRF3^Ser396水平的增加(图2f)。IRF3下游的几个基因(Ifit1、Ifi44、Ifih1、Cxcl10、Rtp4)的转录水平在老年视网膜中也显著上调(图2)。由于在多个器官中观察到年龄相关的线粒体自噬增加(图1b)，研究人员还评估肝、脑、肾和肌肉中的cGAS/STING激活(附属图5)。老年小鼠肾脏和肌肉样本中的STING水平明显高于年轻小鼠(附属图5)。此外，研究人员还使用来自C57BL/6J小鼠的公开转录组数据(GSE141252)分析17个不同器官和5个不同年龄组(4、9、12、18、24个月)的cGAS/STING介质和下游靶基因的水平，在分析的17个器官中的12个(肾上腺、棕色脂肪组织、小脑、脑额叶皮层、心脏、肾脏、大肠、肝脏、肺、肌肉、皮肤和白色脂肪组织)中观察到转录物水平增加的共同模式，表明老龄小鼠cGAS/STING介导的炎症增加并不仅限于视网膜。    

图2 老年小鼠mtDNA释放增加触发cGAS/ STING介导的炎症。

研究人员继而研究在老年小鼠中观察到的线粒体自噬、mtDNA释放和cGAS/STING激活的增加是否也在不同物种中保守。首先，对先前发表的数据(GSE113957)进行转录组学分析，这些数据来自原发正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)并按照临床指南被分类为儿科、青年、成人、中年人、老年人或老年(图3a)。与在小鼠中的研究结果相呼应，老年组显示出最高水平的cGAS/STING介质和下游IRF3靶点(图3b)，并且相对于所有其他组，干扰素应答(IFN-α，IFN-γ)和TNF-α信号的富集(图3b)。此外，与其他组相比，在老年组中上调的DEG中，50.3%对应于ISG并被归类为干扰素I型应答基因(图3d)。对IFIH1和RTP4(IRF3的下游靶点)表达的相关性分析显示，与年龄呈正相关(图3e)。最后，对年轻人(28岁)和老年人(62岁)的原代人真皮成纤维细胞分析(图3f-g)显示，老年人组pUb^Ser65（图3h)和细胞质DNA病灶(图3i)水平明显较高。这些数据支持cGAS/STING介导的炎症增加与线粒体自噬之间的年龄依赖性关联，并表明这种关联在器官和物种中是保守的。这些观察结果表明，随着年龄的增长，PINK1/Parkin介导的线粒体自噬可能选择性上调，以改善线粒体质量控制并抵消mtDNA的释放，从而限制cGAS/STING的激活。    

图3 在老年供体的原代人真皮成纤维细胞中也观察到cGAS/STING被细胞质DNA激活。

3.老年小鼠线粒体自噬的药理激活可减少神经炎症，改善神经功能。

最近的研究强调线粒体自噬诱导剂在动物模型中又延长寿命和健康寿命的能力，以及它们在治疗老年痴呆症和肌肉减少症等与年龄相关的疾病方面的潜力。前期观察显示，线粒体自噬随着生理衰老而上调，研究人员假设药物诱导线粒体自噬可以改善一些与衰老相关的有害变化(即神经炎症和神经和视觉功能的下降)。所以使用线粒体自噬诱导剂尿素A(UA)进行一项干预研究，UA是一种从石榴或覆盆子等可食用植物和水果中提取的天然代谢物，已经在临床试验中进行研究。对幼年(6个月)和老年(22个月)小鼠进行神经生理、行为、视网膜免疫组织化学和转录组学分析，这些小鼠每天腹腔注射UA (2.3 mg/kg)或对照溶剂，持续8周(图4a)。脑灌注质谱(UPLC-ESI-QTOF-MS)和阳性对照血浆样品显示，游离UA穿过血脑屏障到达中枢神经系统(图4a)。UA处理显著增加年轻和年老小鼠的神经视网膜(图4b)和RPE(图4c)的有丝分裂。作为一般神经功能读数的后肢握紧评分，老年UA治疗小鼠与药物治疗小鼠相比显著降低(图4d)。使用新对象识别(NOR)测试对接受UA治疗的老年小鼠进行评估，与对照小鼠相比，接受UA治疗的老年小鼠也表现出更好的识别记忆(图4e)。通过视网膜电图(ERG)视网膜神经生理学评估，结果显示经紫外光处理的老年小鼠显示出暗视力的改善表明杆状细胞介导的视觉功能得到改善(图4f-g)。免疫组织化学表明，UA改善老年小鼠CtBP2+mGluR6+突触的完整性(图4h)，进一步表明UA促进衰老过程中视觉功能的保存。UA还降低脂质过氧化引起的4-HNE+聚集体(图4i)，表明线粒体质量控制的改善也可能减少老化视网膜中的氧化应激。光学相干断层扫描(OCT)分析显示，没有重大的形态学变化(图4j)且主要视网膜细胞类型的数量没有变化。    

图4 促进线粒体自噬可改善与年龄相关的神经衰退。    

至关重要的是，UA刺激线粒体自噬降低衰老视网膜中胞质DNA(图5a)和DNA结合cGAS(图5a)的水平。此外，干扰素应答(IFN-α，IFN-γ)和TNF-α信号的信号传导是老年小鼠中正向富集的前3个标志(图2b)，也是未治疗的老年小鼠中负向富集的前3个标志(图5b)。老年小鼠在UA诱导有丝分裂后，cGAS/STING介质和下游基因的转录水平也降低(图5c)。传统上，视网膜老化也与神经胶质炎症反应增加有关。UA处理的老年小鼠显示胶质纤维酸性蛋白/GFAP+星形胶质细胞增生显著减少(图5d)，离子钙结合适配分子1/Iba1+小胶质细胞浸润略有减少趋势(图5e)，提示cGAS/STING信号的减少也可能直接减少胶质细胞活化。

图5 在老年小鼠中观察到，UA治疗可减弱cGAS/STING反应的增加。

4.UA诱导线粒体生物发生并改善线粒体功能。

UA也被描述为同时刺激线粒体生物发生，以便在线粒体自噬诱导后恢复健康的线粒体池。在UA处理的小鼠视网膜中，FIS1-GFP+确实增加，这一现象在老年小鼠中更为明显(图6a)。为进一步分析cGAS/STING、线粒体自噬和线粒体稳态之间的相互作用，研究人员利用ARPE-19细胞系建立体外mtDNA释放模型。ABT-737是Bcl-2抑制剂，触发线粒体外膜Bax/Bak孔的形成，导致其内部成分(包括mtDNA18)的释放。用泛caspase抑制剂Q-VDOPh (QVD)处理细胞，抑制细胞色素c释放诱导细胞凋亡(图6b)。用ABT-737处理增加细胞质DNA病灶的数量，当细胞与UA共处理而不与选择性cGAS抑制剂G140共处理时，这种现象完全恢复(图6c)。此外，ABT-737也刺激cGAS/STING信号级联，而UA和G140都消除了这种作用(图6d)。上述数据表明UA通过促进线粒体质量控制和消除其触发事件(mtDNA释放)而不是调节下游信号传导来减少cGAS/STING介导的炎症。当细胞与G140共处理时，ABT-737诱导的线粒体自噬明显减少，这表明线粒体自噬确实是对cGAS/STING激活的细胞保护反应(图6e)。与在小鼠视网膜上的研究结果相似，UA也在ABT-737模型中诱导线粒体生物发生，并略微减少线粒体ROS的产生(图6f)。最值得注意的是，线粒体呼吸测定分析显示，UA恢复ABT-737处理细胞的基础呼吸和ATP产生，并显著改善备用呼吸能力(图6g)。    

图6 UA诱导线粒体生物发生，改善线粒体功能。

5.UA刺激PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬介导细胞质ABT-737诱导的DNA减少。

最后，为充分确定线粒体自噬是否是UA发挥作用的唯一原因或者线粒体生物发生是否也参与其中，研究人员在ARPE-19细胞中评估发现PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬(图7f)和/或线粒体生物发生(图7c)同时下调。PINK1/Parkin敲低有效地消除ABT-737和UA诱导的线粒体自噬，线粒体生物发生抑制对线粒体自噬水平没有影响(图7a-b)，也没有影响UA诱导的胞质DNA减少(图7d-e)。然而，PINK1/Parkin敲低完全消除ABT-737处理细胞中UA介导的胞质DNA聚焦减少(图7e-f)，这表明该途径确实负责减少mtDNA释放。结果进一步证实UA通过激活PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬来减少mtDNA释放和炎症反应，从而可能对老年相关的神经退行性疾病具有治疗潜力。    

图7 UA刺激PINK1/帕金森依赖性线粒体自噬介导ABT-737诱导的胞质DNA减少。

文章小结

本研究发现通过诱导线粒体自噬可减少线粒体mtDNA的释放，进而抑制cGAS/STING激活。这篇文章的实验设计思路是多层面、系统性的，提出线粒体自噬在老化过程中的新见解，特别是在调控与年龄相关的炎症反应方面。科学研究的最终目的就是挖掘新靶点，开发新药物，为患者的治疗提供方向，最终期待治愈患者。看到这篇文章心不心动？是不是也想发高分文章？假如你实验亦或论文遇到了困难，不要焦虑，不妨联系一下大海哥？大海哥不才，课题设计、生信分析、论文润色等方面都比较擅长，快扫码联系，让大海哥成为你科研道路上的护航者吧！