【推荐】探索POC技术在呼吸道诊断中的应用与趋势

文摘   2024-10-08 09:23   澳大利亚  
迈迪安开通服务号啦!
欢迎大家关注全新服务号,及时获取信息↓










呼吸道感染

是最常见的传染病之一,且常在短时间内广泛传播,有时甚至引发全球性大流行。呼吸道病毒引发的严重感染多次威胁公共健康,造成重大社会影响,如2003年的SARS, 2009年甲流H1N1­,以及2020年的新冠。

准确的感染诊断对于疫情控制至关重要,能帮助识别传染者、监测病情并提供公共卫生和治疗数据。理想的检测应具备高灵敏度和特异性,能在30分钟内出结果,且成本低、便携、易于非专业人员操作。POC检测通过小型化诊断设备,可在药房、学校、机场等场所使用,尤其适合资源有限的地区。

过去三十年,由于研究资金和商业投资的增加,POCT技术迅速发展,简化了实验室诊断流程,并在微流控芯片纸基平台中取得显著进展。

本文总结了呼吸道病原体POCT诊断的主要技术,重点针对微流控芯片和纸基检测这两种最被看好的POCT平台,在免疫和分子诊断中的趋势,通过比较时间、检测限(LOD)等指标讨论其优缺点及最新应用。

呼吸道病原体诊断的POC技术

在呼吸道病毒的POCT中,主要诊断靶标包括特定生物标志物的分子识别,如病毒衣壳上的独特抗原、核蛋白以及病毒基因组DNA或RNA中的特定序列。

­呼吸道病毒的诊断技术主要是免疫检测分子检测

  • 免疫诊断基于抗体与病毒抗原或其他特异性分析物的结合。POCT中的免疫诊断学利用单克隆抗体结合相关分析物和二抗,以及信号产生反应,确保检测的灵敏度和特异性。

  • 分子诊断则依赖于呼吸道病毒特定基因的核酸序列。POCT的灵敏度对准确诊断至关重要,检测极限受患者样本中病毒载量的影响,且病毒载量因感染类型和阶段而异。了解这些因素对开发和优化有效的呼吸道病毒POCT至关重要。随着核酸扩增技术的进步,分子诊断在早期检测中显示出高灵敏度和高特异性。许多基于分子诊断的POCT平台已整合多种技术,以准确、灵敏和特异性地检测呼吸道病毒。

 1、使用抗体的免疫检测

抗原与抗体之间的高度特异性结合为呼吸道病毒检测提供了高效的诊断工具,且检测周转时间相对较短。

在抗体检测技术中,酶联免疫吸附检测(ELISA)是最常用的抗原检测方法之一。它通过夹心试验结合两种抗体,并利用标记或相关酶的活性产生光学变化,例如比色信号。ELISA通常在含有共价结合抗原或抗体的96孔微孔板上进行。尽管ELISA在资源有限的情况下应用广泛,但其多重反应和洗涤步骤存在一定局限性。

另一种重要的抗体诊断技术是免疫层析(LF),该技术通过多孔膜诱导毛细血管作用与免疫反应检测目标分析物。LF具备速度快、易于存储与运输、操作简单、成本低、适合大规模生产等优点。与ELISA类似,LF使用两种具有单个分析物结合位点的抗体来选择性检测条带上的病毒颗粒。

免疫检测的优点在于快速获得结果、易于使用和具成本效益,但其缺点包括灵敏度有限、交叉反应性强、依赖训练有素的人员以及病毒亚型检测能力有限


2、RT-qPCR分子检测


在2020年新冠引起的全球公共卫生问题之后,RT-PCR技术被CDC认为是“金标准”。RT-PCR检测结果可靠性较高,在POCT中发挥了重要作用。然而,标准PCR过程可能需要超过2小时才能在样品制备后获得结果。此外,需要专门PCR仪器来进行精确的温度循环。因此,标准PCR测定仅限于在实验室内需要专业人员操作使用,且由于耗时,效率可能不够高


3、等温扩增


为了提高分子扩增的效率和便携性­,几十年来,越来越多的研究人员一直致力于开发等温核酸扩增方法。与PCR相反,等温扩增技术允许在相对较低且恒定的温度下扩增靶标,而不会损失产率,例如LAMP,NASBA,RPA,SDA等。


4、CRISPR-Cas技术


CRISPR技术源于原核生物的抗病毒防御机制,成为一种可编程且高度特异的基因编辑工具。该技术因其高灵敏度和特异性,广泛应用于单细胞成像、单核苷酸变异分析以及DNA/RNA传感等领域,尤其用于核酸检测。

SHERLOCK是基于CRISPR的高级核酸检测系统,依赖于Cas13a酶,当识别到特定DNA靶标时会激活其非特异性核酸酶活性。SHERLOCK系统的关键组成包括Cas13a酶、向导RNA和特定的靶向扩增产物。向导RNA由与Cas酶结合的部分和与靶向核酸互补的部分组成。三者结合后触发Cas13a的酶活性,切割带有荧光和猝灭标记的探针,从而产生荧光信号。

改进版SHERLOCKv2通过侧流试纸条实现可视化的颜色变化,简化检测结果的解读,无需荧光检测仪器。此外,SHERLOCKv2将整个检测过程整合为一步操作,无需纯化或分离核酸。在COVID-19期间,SHERLOCK获得CDC批准,用于快速筛查无症状患者。


呼吸道诊断的样本

呼吸道病毒的采样是呼吸道病毒POCT的关键环节。大多数POCT方法从上呼吸道(如鼻腔、鼻咽或喉部)采集样本,通常使用拭子进行后续检测。通过图1显示的POC检测过程可以看出,样本处理对检测性能和流程有重要影响。

图1. POCT的优势及检测的四阶段。POCT是在患者所在地或附近进行的医学诊断测试。POCT涉及四分析阶段:样品处理,在平台上加载,检测分析物和读取结果。

近年来,使用呼气作为采样方法逐渐受到关注,因为呼气中含有可能携带病毒颗粒的小液滴,这种方法非侵入性且成本低。鉴于历史上严重流行病与空气传播病原体有关,有效检测空气传播的病原体在现代社会中愈加重要。现已开发出生物气溶胶采样/监测系统,可与快速诊断技术集成于简易平台上。一些研究表明,呼气样本与标准液体样本在检测一致性方面表现良好。然而,使用气体样本进行呼吸道病毒的POCT(包括呼气和生物气溶胶)仍需进一步研究,以验证其在不同条件下的可靠性。

此外,唾液被证明是替代鼻咽拭子的有效呼吸道诊断样

呼吸道POC诊断的代表应用

诊断技术通常通过微流控或纸基平台实现简化和微型化以便进行快速、便携且易于使用的现场检测。一些研究提出了结合磁体分子探针信号染料的独特检测方法,这些方法利用成熟技术生成比色结果,以高效检测呼吸道病毒(见图2)。

图2. 最新POCT技术范例

图2a展示了一种便捷的ELISA技术,结合磁体辅助移液,成功应用于甲流病毒的检测。在此方法中,磁珠与捕获抗体-靶蛋白复合物结合,并通过环形钕磁体在移液头分离目标蛋白。抗体与甲型流感病毒核蛋白结合后,辣根过氧化物酶(HRP)生成比色信号。整个ELISA流程,包括结合、清洗和信号生成,通过磁珠和磁性移液装置在50分钟内完成,灵敏度为104EID50,比侧流检测系统高100倍。

图2b展示了一种利用适配体代替抗体的酶联寡核苷酸检测(ELONA)技术,应用于甲型流感病毒的检测。选定的DNA适配体与H1N1和H3N2病毒在金电极表面结合,生成电化学信号。该检测在60分钟内完成,检测限低至0.9pg/μL。

图2c展示了结合LAMP检测与酚红型pH指示剂的比色信号,用于检测SARS-CoV-2。该方法在对COVID-19患者呼吸道拭子提取的RNA样本进行验证时,性能与商业RT-qPCR相当。120个拷贝的纯化RNA在30分钟内被检测到,颜色从粉红色变为黄色。这种比色LAMP方法在无需昂贵仪器的情况下实现了实验室外的检测,为COVID-19提供了实用且快速的诊断工具。

此外,还有一种名为“Penn-RAMP”的单管检测方法,将RPA与LAMP相结合,已被报道用于家庭、诊所和入境点的COVID-19检测。Penn-RAMP采用两阶段等温扩增,首先对添加RNA的鼻拭子进行RPA反应,然后将RPA产物与LAMP溶液混合。在闭合管中进行的高灵敏度LAMP反应同时生成荧光和比色信号,检测限为7拷贝,所需时间为40分钟。

图2d展示了使用CRISPR-Cas12a分子探针在单管反应中快速检测SARS-CoV-2的技术。在目标序列的RPA反应中,一对crRNA在双重CRISPR检测中发挥关键作用,提升了比色和荧光报告的灵敏度。CRISPR-Cas12a系统的分子探针在40分钟内可达到10拷贝的检测限。这些方法展示了与便携平台或微型系统结合后的良好POCT潜力。

微流控平台的呼吸道POC检测

微流控芯片是通过光刻技术或其他原型制作方法,在玻璃、硅或聚二甲基硅氧烷(PDMS)等材料中形成的微型流体电路。这种系统能够实现复杂的实验室设置,具有减少样品和试剂用量、精确控制流体流动和快速分析的优点。

随着制造技术和纳米通道的进步,微流控设备被称为“实验室芯片”(lab-on-a-chip),能够处理极小的流体体积,具备低成本、快速分析和良好的样品浓度控制等优势。该技术在医学诊断中得到广泛应用,特别是在免疫和分子诊断方面,过去20年微流控设备的临床性能逐步提高

微流控芯片通常依赖外部设备操作,如气动泵、阀门和流体通道。由于复杂的流体控制系统,一些微流控平台需要中心实验室设备或昂贵仪器进行现场分析,这限制了实验室芯片技术的实际应用。为了解决这些问题,近期研究通过磁力、离心和试剂存储有效替代泵、混合和洗涤过程,从而开发出实用的POCT平台。这些方法使微流控设备成为快速、准确且自动化的呼吸道病毒感染诊断工具。近期在微流控平台上开发的一些POCT方法如图3所示,涵盖了抗体夹心检测、RT-PCR和LAMP等技术。

图3. 微流控平台上呼吸道病毒的POCT范例

图3a展示了一种基于磁珠的自动化抗体测定,用于检测多种流感病毒。该实验结合磁性和尺寸介导的微流控芯片,通过多路流体阀和计算机程序控制实现自动操作。磁分离捕获复合物并与量子点反应生成荧光信号,能够在20分钟内同时检测H7N9(低至3.4ng/mL)和H9N2(低至4.5ng/mL)等多种流感亚型。

图3b是结合智能手机的微流控POCT系统,用于检测禽流感的比色法。在PDMS芯片表面,利用ZnO纳米棒模板形成流感病毒、金纳米颗粒、抗体和银壳复合物的三维结构。多个过程在微流控环境中完成,最终通过带偏振器的智能手机进行比色检测,分析时间为90分钟,能够检测到8×10³EID50/mL的流感A病毒,灵敏度超过传统荧光ELISA的三倍。

此外,已有研究报道了一种用于流感H1N1病毒的数字微流控免疫测定平台,利用磁珠上的适配体和抗体进行检测。含磁珠的液滴通过电磁力在芯片的疏水表面移动,结合的HRP产生荧光信号,检测时间为40分钟,灵敏度达到0.032血凝单位/反应。

图3c展示了一种集成微流控芯片,用于快速多重检测流感A病毒亚型。该芯片通过RT-PCR利用糖基涂层磁珠,实现甲流病毒的多重诊断,整体分析过程在100分钟内完成,检测限为40–3000拷贝。

图3d是一种实时比色检测甲流/乙流病毒的微流控芯片,核酸提取与靶特异性等温扩增在集成微腔的八通道芯片上完成,检测限为50–200拷贝,灵敏度为96%,特异性为100%。

图3e展示了一种微流控离心盘,采用LAMP技术快速检测流感病毒亚型,能够同时检测六种流感病毒,检测限为20–100拷贝,适用于临床样本。

此外,近期报道的高灵敏度反转录数字PCR(RT-dPCR)技术用于SARS-CoV-2检测,检测限为每反应2拷贝,分析时间为50分钟,针对真实患者样本的诊断准确性达到93%。同时,也发布了结合微流控结构的多重免疫诊断技术,实现对SARS-CoV-2、甲流、乙流、腺病毒和呼吸道合胞病毒的集中检测。
纸基设备的呼吸道POC检测

纸基免疫检测因其低成本、快速反应和操作简便而备受关注,尤其是在POCT领域,免疫层析(LF)技术广泛应用于孕检和尿检等。尽管纸基免疫检测在高灵敏度和定量分析上存在局限,但其实用性和潜力不容忽视。

近年来,结合核酸扩增技术的纸基设备取得了显著进展,成功实现了简化的核酸提取、扩增和检测模块。但能够实现从样本到结果整合操作的纸基设备仍较为有限,制约了其在实际POCT中的应用。

图4. 纸质检测平台上呼吸道病毒的POCT范例

应用纳米技术的纸基免疫检测代表了该领域的重要发展。例如,图4a展示的上转换纳米颗粒复合物用于检测禽流感病毒,合成的近红外(NIR)上转换纳米颗粒与LFA试纸结合,表现出快速和高灵敏度的性能,检测限为102–103.5 EID50/mL,分析过程在20分钟内完成。

图4b展示了使用表面增强拉曼散射(SERS)标签的磁性纳米颗粒替代金纳米颗粒进行信号探测的系统,灵敏度是标准LFA的2000倍,30分钟内检测到50PFU/mL的甲流H1N1和10PFU/mL的人腺病毒。

图4c展示了一种纸堆叠垂直流结构用于流感病毒电化学和比色检测,样本注入到检测的过程在6分钟内完成,成功检测到1–4 PFU/mL的甲流H1N1病毒。

纸基平台上也积极开发利用核酸检测技术。图4d展示了一种通过金纳米颗粒结合物和DNA探针进行RPA扩增产物比色检测的垂直流微阵列,检测限为2000拷贝DNA每反应。双重RPA与LFA结合,可在一次性设备中成功检测到50–500拷贝RNA,扩增和检测在40分钟内完成。

最近,结合CRISPR-Cas技术的等温扩增检测策略引起广泛关注,展现出对SARS-CoV-2的高度灵敏检测潜力。基于CRISPR的侧流检测在60分钟内能够检测到10–100拷贝的SARS-CoV-2 RNA片段。图4e展示了结合LAMP和CRISPR-Cas12a检测SARS-CoV-2的结果,检测限为70拷贝,临床样本分析中灵敏度为95%,特异性为100%。

呼吸道POC检测发展现状

表1和表2中总结了不同研究的基础信息,包括所需时间、检测限值及WHO制定的ASSURED标准的定性比较。此比较未考虑技术细节差异,便携性和高集成设备在POCT中至关重要,同时也是实现理想POCT技术的主要挑战。

表1. POCT在免疫检测中的总结 (点击图可放大)

表2.  POCT在分子检测中的总结点击图可放大

表3列出了已在市场上商业化的代表性产品,并评估了其对临床样本的灵敏度和特异性。这些商业产品经过严格评估,灵敏度和特异性高于研究报告。产品的成本效益通过美国市场的售价进行比较,便携性和操作便利性则基于重量、尺寸及存储条件进行评估。

表3.  商业呼吸道POC检测点击图可放大

许多商业产品采用独特技术实现简单、准确且低成本的呼吸病毒POCT。例如,Cepheid的GeneXpert通过一次性试剂盒实现从样本处理到结果的自动化,而Abbott的BinaxNow则使用侧向流技术快速分析样本。近年来,一些快速检测SARS-CoV-2的产品也被开发出来,虽然这些技术在灵敏度和特异性方面表现良好,但在早期诊断应用中存在一定局限性。

在分子和免疫诊断方面,趋势显示显著差异。分子诊断主要基于PCR和微流控平台,而免疫诊断则多采用纸基LF平台。

微流控PCR技术高灵敏,但成本较高;纸基LF产品成本效益好,但灵敏度和特异性仍有限。通过在表3中展示这些特点,可以更清晰地看出呼吸病毒POCT的未来发展趋势和挑战。

图5. 呼吸道POC诊断的现状

通过图5可以看出POCT技术的现状在免疫诊断方面,纸质平台的检测速度和灵敏度优于微流体平台,这使得纸质平台在当前趋势中受到更多关注和投资。因此,商业化技术也逐渐增加了纸质平台的使用。 

在分子诊断领域,微流控方法接近最先进技术。纸质设备仍需整合整体流程,并在快速且高敏感的呼吸病毒检测方面存在局限。大多数关于纸质平台的研究仍需独立的溶液室进行核酸提取和扩增,这导致分析时间延长。分子诊断技术(包括PCR、LAMP和RPA)在每次检测中的复杂过程通常需要比免疫检测更长的时间,因此,微流体技术的高度专业化和流体控制技术为开发POCT的小型化平台提供了优势。商业化技术主要利用微流控实现从核酸提取到高灵敏度扩增的复杂过程。

为了克服当前的局限性并在紧急情况下应用POCT,需要在快速操作、便携性、易于制造、操作、存储以及高灵敏度的质量上对POCT平台进行迅速改进。根据当前趋势,多个领域展现出显著潜力,尤其是(1)等温核酸扩增,(2) 基于纸质平台的分子诊断,(3) 基于其他先进技术的高灵敏度免疫测定。

总结来说,纸质平台的免疫诊断和微流体平台的分子诊断在当前POCT技术的发展中受到了特别关注。POCT技术的成功商业化需要考虑高度集成的手持式和便携式平台。测试结果的准确性和可靠性对于确保偏远或资源有限地区患者的安全与健康至关重要。此外,经济高效的POCT技术可以增加检测的可及性和大规模生产的能力。

理想的POCT系统应具备高灵敏度、快速分析、低成本、便携和易操作等特性。纸质平台在低成本应用中优势显著,但整合过程仍面临挑战。针对呼吸病毒的POCT研究正朝着这一最终目标发展。通过这些努力,先进的POCT有望成为医疗系统中用于早期诊断、预防和监测呼吸病毒感染所引发的重复危机的核心技术。

迈迪安的呼吸道POC检测解决方案

迈迪安针对呼吸道疾病的POC检测提供全面的解决方案,既包括用于快速免疫层析的抗原抗体,也包括使用qPCR或LAMP技术的分子检测原料,以满足各种检测开发的需求,阅读下文了解更多:

精准诊断:呼吸道传染病多重检测&POCT的全面解决方案》

欢迎扫码下图二维码收看我们近期举办的线上讲座,了解更多解决方案:


扫描图中二维码收看线上讲座













扫描订购样品



📞欢迎联系关注和咨询我们📰

本文图片和内容均来自:

Trends of respiratory virus detection in point-of-care testing: A review, 

Anal Chim Acta. 2023 Jul 11; 1264: 341283. doi: 10.1016/j.aca.2023.341283

精选专题



迈迪安血液分子检测系列

迈迪安唾液分子检测系列

迈迪安尿液分子检测系列

迈迪安粪便分子检测系列

迈迪安LAMP检测系列

迈迪安免疫检测原料

迈迪安液体活检推荐系列

迈迪安分子POCT系列

迈迪安分子核心酶系列

迈迪安直播系列

迈迪安季刊合集


END

北京迈迪安生物科技有限公司是Meridian Bioscience在中国设立的全资子公司。Meridian BioScience (以下简称:迈迪安)是一家全球领先的生物诊断公司,总部设立在美国,距今已有45年的历史。迈迪安公司分为诊断和生命科学两个部分,在中国地区的主营业务是生命科学产品,包括各种分子和免疫诊断检测的关键原料,如抗原抗体、免疫阻断剂、PCR和LAMP反应的聚合酶和优化的预混液、核苷酸等,为人体、动物、农业、环境及食品安全等各种检测提供全面的解决方案。45年来,迈迪安已经成为全球各领域诊断企业的首选原料供应商!



点击下方“阅读原文”查看更多

Meridian Life Science
Life Discovered,Life Diagnosed.全球知名诊断领域领导者,美国Meridian Bioscience 中国分公司。
 最新文章