浅谈示踪病毒在神经环路研究中的使用
（图1）
（图2）
在该研究中，研究者们发现光刺激通过激活内在光敏性视网膜神经节细胞(intrinsically photosensitive retinal ganglion cells , ipRGCs) 调控小鼠糖耐量。该研究利用一系列示踪病毒工具结合基因鼠，完整地解析了光刺激激活ipRGC-SONOXT-SONAVP-PVN-NTSVgat神经环路最终靶向抑制棕色脂肪的产热作用介导的糖代谢调节过程（图2）。最后，他们也在志愿者中验证了光照在棕色脂肪产热调节激活的状态下可以调节糖代谢。
（图3：文中所用病毒）
各种病毒包括顺行性、逆行性、跨突触与非跨突触以及化学遗传学病毒在该研究中都有被涉及（图3），被用于揭示神经环路中各级神经元之间的解剖与功能联系。在早期的研究中，解析神经环路所使用的工具主要是各种示踪剂，包括HRP、蛋白质、荧光染料、生物素以及放射性标记的氨基酸等，通过顺行性或逆行性地标记神经元的胞体与轴突，并使用光学或放射性检测技术验证神经环路中不同区域的连接。而随着技术的发展，大量病毒工具被设计改造，获得在胞体与轴突中表达递送荧光蛋白的能力，得以被用于解析神经环路。并且由于可以嵌入各种外源性元件，病毒工具在解析神经环路的过程中可以实现长时稳定表达、条件性表达，表达抑制和兴奋性受体等多种特性，是功能十分强大的工具【2】。
（图4）
病毒顺行性标记是病毒通过感染神经元的胞体，表达荧光蛋白并递送至轴突末梢，从而标记完整的神经环路。接下来以该研究中的实验举例：为了证明ipRGCs与SCN、SON这两个核团之间的解剖学联系，研究者在OPN4-Cre小鼠的玻璃体腔中注射了AAV2/2-DIO-ChR2-EYFP病毒，使得EYFP和ChR2在ipRGCs中特异性地表达。接着研究者发现在SCN、SON两
个脑区中发现了EYFP荧光的表达（图4），这说明ipRGCs的轴突在SCN、SON两个脑区有一定的分布。
（图5）
病毒逆行性标记是病毒通过感染神经元的轴突末梢，经轴突传递至胞体并表达传递荧光蛋白，从而标记完整的神经环路【3】 。同样以该研究中的实验举例：研究者在SCN、SON这两个核团注射AAV2/2Retro-DIO-ChETA-EYFP病毒，然后在视网膜中表达特异性表达Cre的ipRGC中也检测到了相应的EYFP的表达（图5）这一逆行性示踪实验进一步验证了ipRGCs的轴突在SCN、SON两个脑区有分布。
（图6）
对于顺行性跨突触标记，该研究使用了scAAV2/1-Cre病毒。该病毒可以从上一级神经元的胞体沿轴突传递至末梢后跨越突触传递至下一级神经元的胞体中【4】。该研究中，在SON区注射的scAAV2/1-Cre顺行性地跨突触进入PVN区的神经元胞体，并诱导了AAV2/9-FLEX-GFP病毒感染的神经元中GFP的表达，最后沿着轴突顺行性到了下级NTS区（图6），从而实现了跨突触的3级脑区标记。
（图7）
以该研究中的跨单级突触逆行性标记举例：首先，NTS部位注射的AAV2/2Retro-Cre沿着轴突逆行至PVN区的胞体表达Cre蛋白。RV-EnvA-ΔG-mRuby3病毒5与其辅助病毒AAV2/5-DIO-H2B-EGFP-T2A-TVA、 AAV2/5-DIO-RVG也被注射至PVN脑区。AAV2/2Retro-Cre在PVN神经元胞体中逆行性表达的Cre蛋白同时诱导了辅助病毒携带的TVA与RVG元件的表达。继而，TVA使该位置的RV病毒特异性地感染支配NTS的神经元，而RVG则使RV病毒获得跨突触逆行性标记至SON区的能力（图7），最终使其能逆行性跨突触标记其上级神经元。
（图8）
以该研究中的跨单级突触逆行性标记举例：首先，NTS部位注射的AAV2/2Retro-Cre沿着轴突逆行至PVN区的胞体表达Cre蛋白。RV-EnvA-ΔG-mRuby3病毒5与其辅助病毒AAV2/5-DIO-H2B-EGFP-T2A-TVA、 AAV2/5-DIO-RVG也被注射至PVN脑区。AAV2/2Retro-Cre在PVN神经元胞体中逆行性表达的Cre蛋白同时诱导了辅助病毒携带的TVA与RVG元件的表达。继而，TVA使该位置的RV病毒特异性地感染支配NTS的神经元，而RVG则使RV病毒获得跨突触逆行性标记至SON区的能力（图7），最终使其能逆行性跨突触标记其上级神经元。
（图9）
化学遗传学病毒可以通过表达激动性或抑制性受体调控某个神经环路位点的功能，结合表型分析，从而实现某一位点在整个环路中的功能验证。该研究使用了激动性与抑制性化学遗传学病毒——AAV2/2-DIO-hM3Dq-mCherry和 AAV2/2-DIO-hM4Di-mCherry【7】。研究者在SON区注射逆行性的AAV2/2Retro-Cre病毒，同时在玻璃体腔注射了上述两种化学遗传病毒。如此，只有支配SON脑区的RGC能够被诱导hM3Dq 和hM4Di的激动与抑制作用（图9），同时检测分析相关表型，从而得以精准验证该环路中的支配SON区的RGC的功能。
