Strategies for neural regeneration 专题研讨会学术回顾

      2023年7月28日，中国神经科学学会第十六届全国学术会议暨第二届中日韩国际会议在中国珠海隆重召开，本次会议汇聚了海内外神经科学领域的知名专家与学者，参会代表超五千人。在本次大会上，由浙江大学周峰泉教授与中国科学院动物研究所刘长梅教授共同组织的“Strategies for neural regeneration: new frontiers and cutting-edge technology”研讨会于28日上午进行。再生医学是从结构和功能两方面修复由衰老，疾病，创伤导致的组织器官损伤。多数成年期发生的神经系统疾病最终导致神经纤维退化和神经元死亡。因此神经元保护，轴突再生和新神经元产生是治疗各类神经损伤的最佳方案。近期许多新技术推动了神经再生领域的快速发展。多组学技术从多维度解析损伤组织中的细胞状态，发现新治疗靶点。单细胞测序/大数据分析全面描绘神经组织微环境内多类细胞间的相互作用图谱。源于人类iPSCs的神经组织类器官可以用模式动物中建立的实验策略对人体组织进行研究。病毒载体的定向编辑使得基因治疗更加高效和准确。研讨会主要目标是对神经再生研究人员介绍领域内研究前沿，也希望吸引其他领域专家进行跨专业合作。

      会议邀请到了美国西奈山伊坎医学院陈波教授、南通大学于彬教授、北京市眼科研究所金子兵教授以及复旦大学脑科学转化研究院邵志成教授分别进行了详细的学术报告并与现场观众进行了热烈的讨论。

Strategies for neural regeneration: new frontiers and cutting-edge technology 

1:Developing new AAV tools to examine in vivo glia-to-neuron reprogramming in the mouse retina（陈波）

      体内神经胶质细胞重编程为神经元是补充丢失神经元、修复受损的神经回路与功能的有效方法之一。在成年哺乳动物视网膜中，将重编程因子高效准确的递送到神经胶质细胞是使其转变为神经元的关键。AAV(腺相关病毒)表达系统是体内递送靶基因的有力工具，陈波教授团队利用AAV-GFAP靶向递送4种重编程因子Neurod1, Math5, Ascl1和Neurog2，检测它们的转分化作用，经谱系追踪发现靶向胶质细胞的AAV错误地渗漏标记原位神经元，而通过降低AAV浓度或改变AAV血清型无法避免这种现象。

       陈波教授团队提出开发新的适用于体内重编程的AAV工具是必要的，其一要确保完全靶向内在胶质细胞，排除感染内在神经元。其二，减少体内错误的胶质细胞-神经元的转变。另外，利用新的AAV工具，将编辑基因设计在GFAP启动子的远端，或者带有AAV-CAG-FLEX的双系统递送工具，均能有效的减少AAV渗漏感染原位神经元，提高胶质细胞到神经元的重编程效果。

问题：Müller细胞转分化为视网膜神经节细胞（RGC）可行吗？

答：目前这还是一个挑战，Müller细胞可转分化为视杆细胞，转分化成RGC目前有很多学者正在努力探究。

2:Epigenetic Regulation of Neural Stem Cells and its application in traumatic brain injury（刘长梅）

      表观调控复合体SWI/SNF家族是调控真核细胞染色质结构与基因转录重要分子，作为SWI/SNF复合体的关键组分Arid1a/1b，其突变与智力残疾(ID)或Coffin-Siris 综合征密切相关。刘长梅教授详细阐释Arid1a在神经发育、再生与认知中的潜在功能角色。首先，研究发现在视神经挤压模型中，缺失Arid1a显著促进RGC的存活。其次，利用条件性Arid1a敲除小鼠，揭示前脑缺失Arid1a显著减少大脑皮层厚度，深层皮层神经元的分化受阻。另外， Arid1a敲除也造成海马发育障碍，神经干细胞增值与分化降低，细胞凋亡显著增加。

      为进一步解析Arid1a调控神经发育和再生的分子细胞机制，刘长梅教授团队研究发现兴奋性神经元中缺失Arid1a导致小鼠学习记忆受损，主要表现为其半敲除后兴奋性神经元突触可塑性受损。同时，敲除Arid1a的人胚胎干细胞系分化来源神经元也表现出形态复杂性降低、功能异常。然而，通过外源补充乙酸盐增强H3K27乙酰化水平，能够显著恢复Arid1a半敲小鼠表现出的认知缺陷与神经元功能异常，表明乙酸盐的补充可能是Coffin-Siris 综合征等智力障碍的潜在治疗策略。

问题：乙酸盐的作用结果是由于Arid1a敲除导致乙酸代谢异常还是染色质调控过程中P300或其他表观调控作用？

答：之前我们没有检测过Arid1a缺失后乙酸代谢水平，但我们在多种小分子筛选后发现乙酸盐具有对整体表型的恢复作用，并进行了Chip-seq检测，发现乙酸盐使用后酰基化修饰结合也被恢复，说明乙酸盐的使用恢复了Arid1a缺失引起的酰基化改变。

3:High-efficient differentiation of human stem cells into functional microglia（金子兵）

      小胶质细胞失调与多种中枢神经系统疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化症等的发生发展密切相关。由于人类小胶质细胞的获得受限以及人和小鼠的物种差异，寻找合适的具有人源小胶质细胞的疾病研究模型亟待解决。来自北京市眼科研究所金子兵教授团队利用多能干细胞在体外高效分化获得人源的小胶质细胞。

      金子兵教授团队成功建立人类多能干细胞分化成高纯度(>92%)小胶质细胞的简化方法，并利用稳定成熟的人视网膜类器官开展常见的眼科疾病研究。在功能上，分化形成的小胶质细胞与原代小胶质细胞相似，表现出小胶质细胞特有的分子特征和功能表型，包括小胶质细胞特异性标志物的表达，外源刺激下释放细胞因子，以及吞噬功能等。诱导分化的小胶质细胞与三维人视网膜类器官(hROs)共培养，小胶质细胞迁移进入hROs，并分化成熟为常驻视网膜类器官小胶质细胞。这种小胶质细胞高效分化的方法打破传统的长时程模式，诱导时间短，功能完整性高等特点，对于疾病建模、药物开发和潜在的细胞替代疗法至关重要。

问题：分化形成的小胶质细胞在类器官中可以增殖吗，在类器官中可以存在多久？

答：是可以增殖的，具有完整的功能，并一直存在在类器官，整合后最长在90天时还是健康的状态。

4:Promoting Axon Regeneration By Inhibiting RNA N6-methyladenosine Demethylase ALKBH5（毛苏苏）

      中枢神经元内在再生能力是限制其轴突再生的关键因素，RNA修饰在这一过程中是否发挥作用尚不清楚。来自南通大学于彬教授团队的毛苏苏老师系统阐释常见的m6A修饰相关酶在轴突再生中的功能。他们发现轴突损伤后，m6A显著富集在神经再生相关基因的CDS区。进一步筛选发现一个进化上保守的RNA m6A去甲基化酶ALKBH5在轴突再生中具有重要的功能。

      在外周神经系统中，ALKBH5的下调增强了感觉轴突的再生，而ALKBH5的过表达则以依赖m6A的方式抑制轴突再生。机制上，ALKBH5能够增加Lpin2 mRNA的稳定性，限制神经元再生相关的脂质代谢。此外，在中枢神经系统中，敲低ALKBH5可增强视神经损伤后视网膜神经节细胞的存活和轴突再生。这些研究结果表明ALKBH5是促进外周神经与中枢神经系统轴突再生的潜在靶点。

问题：ALKBH5与Lpin2两个分子的均能调控神经再生，哪个分子更有应用前景，Lpin2是否更特异？

答：我们在外周神经系统中发现ALKBH5下游调控Lpin2，但在中枢神经系统中ALKBH5的下游分子是否为Lpin2还未知，后续更关注中枢神经系统的再生。

5:Generation of human spinal cord organoids for spinal cord regeneration（邵志成）

      脊髓全横断损伤后神经组织完整性缺失是不可逆的，往往导致下肢功能性瘫痪。愈来愈多证据显示具有一定结构特征的人脊髓类器官移植可作为脊髓损伤修复的潜在治疗策略。来自复旦大学脑科学转化研究院邵志成教授团队长期探索人类星形胶质细胞直接重编程或功能化复合支架生成脊髓类器官的新方法。邵志成教授团队利用人星型胶质细胞重编程方法，成功建立自组装形成皮层类器官，评估形成的类器官有效细胞类型。利用小鼠T8-T10节段缺损（2mm）脊髓损伤模型，将构建的类器官移植到损伤部位，检测发现移植的类器官能够存活并整合，分化的脊髓神经元生长出长距离轴突，与原位神经元形成突触连接，恢复小鼠部分运动功能。另外，结合生物材料分化形成类器官移植到脊髓损伤模型显示出更好的功能表型，建议人脊髓类器官移植有望成为干预完全性脊髓损伤的一种有效策略。

问题：形成的类器官分左右脑吗？

答：很好的问题，我们也关注了这个问题，但目前还没有实现。

6:The landscape of retinal cell-cell communications through single cell RNA-seq and its application in retinal disease（周峰泉）

      在机体内细胞间协调互作支持正常生理功能，任何细胞的生理功能或功能障碍与所处的微环境密切相关。在视网膜中多种细胞互作对视网膜回路的形成至关重要，并维持成年动物的视网膜功能与损伤后的组织修复。

      来自浙江大学的周峰泉教授团队利用单细胞测序技术系统地绘制基于配体-受体和其他相关基因表达的视神经损伤模型小鼠视网膜细胞间通讯图谱。研究发现视网膜神经节细胞与邻近细胞间互作的数十种配体-受体具有潜在的神经保护功能。在视网膜损伤模型中，周峰泉教授团队发现高存活率的RGCs与其他视网膜细胞有更多的配体-受体相互作用，表明配体-受体介导细胞间交流调控视网膜神经节细胞的存活。其中，功能性分析显示与痛觉整合及感受相关的阿片受体 (Oprm1) 在存活更好的光敏视网膜神经节细胞(ipRGC)中特异性表达。利用视神经挤压伤、兴奋性毒性损伤和青光眼模型，研究发现在其他类型RGC中过表达Oprm1，能够显著促进其他类型RGCs的存活，显著改善了视觉引导感知行为。这些结果表明操纵神经元微环境感知能力或所处组织微环境能够改善损伤后神经元的存活，为内源性调控神经再生或神经保护提供了新视角。

问题：在Oprm1过表达后，是否还需要利用其配体Morphine处理获得更好的效果？

答：我们后续会增加既过表达Oprm1，同时注射Morphine的实验，检测是否能够更好的保护神经元的存活。