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Philip C.Wong | Johns Hopkins Medicine
研究背景
肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）是一类严重的神经退行性疾病，它们影响着全球众多患者的生活质量。然而，由于缺乏有效的早期诊断手段，许多患者在出现明显症状时，疾病往往已进展至较为晚期的阶段，错过了最佳治疗时机。在这些疾病中TDP-43（TAR DNA结合蛋白43kDa）失调是一个公认的病理特征，特别是在疾病后期的尸检样本中。TDP-43的功能之一是参与RNA剪接，控制某些基因的表达，而其功能失常可导致异常的RNA剪接事件，比如隐匿外显子的错误包含。然而，TDP-43功能障碍在疾病早期阶段的具体作用和能否作为早期诊断的标志仍然缺乏认识。来自约翰斯霍普金斯大学的 Philip C.Wong团队在《Nature medicine》期刊上发表题为“A fluid biomarker reveals loss of TDP-43 splicing repression in presymptomatic ALS–FTD”的文章，该研究通过鉴定一种新的生物标志物，详细揭示了在ALS和FTD无症状阶段TDP-43蛋白剪接抑制功能丧失的情况。TDP-43功能丧失是疾病早期甚至前临床阶段的事件，而新发现的生物标志物可为ALS-FTD的早期诊断及临床试验患者招募提供重要依据，同时有助于监测干预效果。此外，由于许多AD病例也存在TDP-43病理改变，这些生物标志物可能对区分单纯AD与混合病因性痴呆具有重要意义，从而指导临床试验分层并评估不同治疗策略的有效性。
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图1 人类TDP-43相关的隐匿外显子的识别和选择过程
隐匿外显子（Cryptic exon）是在正常情况下不被剪接进成熟mRNA中的外显子序列，但在特定条件下，如基因调控异常时，会被错误地包含进mRNA中。通常，它们是由于RNA剪接机制失误或RNA剪接因子功能失调而被意外识别并保留下来的。TDP-43是一种关键的RNA结合蛋白，参与调控基因的剪接过程。在正常的生理状态下，TDP-43通过识别并结合到特定RNA序列（如UG重复序列）上来抑制隐匿外显子的剪接，确保RNA剪接的精确性。在神经退行性疾病如ALS和FTD中，TDP-43的功能受到影响，其可能会从细胞核转移到细胞质中形成聚集体，或者表达量下降，导致其在细胞核中的正常功能丧失。这种情况下，TDP-43无法有效抑制隐匿外显子的识别与剪接，从而使得原本不应被包含的隐匿外显子被错误地纳入到成熟的mRNA中，最终影响编码蛋白的结构和功能。研究团队首先通过RNA测序技术（RNA-seq）分析了HeLa细胞和利用小干扰RNA（siRNA）去除了TDP-43的诱导多能干细胞衍生的运动神经元，以此来识别一系列与人类TDP-43相关的隐匿外显子。为了开发特异性单克隆抗体，研究团队基于以下标准选择了某些隐匿外显子作为目标：1.隐匿外显子以读码框内插入的方式拼接，且不含有提前终止密码子，这意味着它不会导致蛋白产物的截断。2.包含隐匿外显子的基因在全身广泛表达或在中枢神经系统（CNS）中高度表达。3.隐匿外显子编码的肽段含有免疫原性的表位，这有利于抗体的识别和结合。使用ASCOT（Alternative Splicing Catalog of the Transcriptome）转录组可变剪接目录，该目录基于公共的大规模RNA测序数据集生成，分析含有TDP-43相关隐匿外显子的基因。研究团队特别关注在读码框内的隐匿外显子，以及在CNS中高表达的隐匿外显子，推测其与ALS-FTD密切相关。之后，研究团队利用AlphaFold蛋白结构预测软件，模拟含有这些隐匿肽段的蛋白，实现可视化隐匿表位的可接近性和预测蛋白的自然构象是否得以保存。最终筛选到一个潜在对象：HDGFL2蛋白。HDGFL2 满足上述筛选标准，且其具有广泛表达的特性。研究团队成功产生了多个针对该蛋白隐匿肽段的单克隆抗体。经过初步筛选，确定出具有更优的特异性和亲和力抗体，将其命名为TC1HDG。通过细胞系实验验证，该抗体可特异性识别含有隐匿肽段的 HDGFL2。图2. 在HeLa细胞中通过siRNA敲低TDP-43后，隐匿HDGFL2蛋白显著增加，表明TDP-43的剪接抑制功能丧失。
HDGFL2隐匿蛋白在ALS和FTD脑组织中的分布
HDGFL2隐匿蛋白在ALS和FTD患者的脑组织中积累，特别是在TDP-43胞质聚集物的神经元细胞核中。这表明隐匿HDGFL2可以作为TDP-43病理改变的早期潜在检测标志物。
图3. HDGFL2隐匿蛋白在ALS和FTD患者脑组织中的免疫组化分析结果，发现隐匿HDGFL2主要积累在TDP-43胞质聚集物的神经元细胞核中。
研究团队开发高灵敏度的夹心ELISA方法，通过MSD平台检测脑脊液（CSF）中的HDGFL2隐匿蛋白水平。通过使用不同抗体配置，研究团队验证了ELISA方法的高特异性和高敏感度。在HeLa细胞中，ELISA方法能够特异性地检测到隐匿HDGFL2蛋白，表明该方法适用于生物样本的检测。
图4. 高灵敏度的ELISA方法以检测CSF中的隐匿HDGFL2
研究发现，HDGFL2隐匿蛋白在家族型ALS-FTD和散发型ALS患者的CSF中累积水平显著高于健康对照组。在家族型ALS-FTD中，HDGFL2隐匿蛋白水平比神经丝轻链蛋白（NfL）和磷酸化神经丝重链蛋白（pNfH）的水平上升更早，显示出其在疾病早期阶段的高敏感性。
图5. HDGFL2隐匿蛋白与神经丝蛋白（NfL和pNfH）在不同疾病阶段的水平变化
HDGFL2隐匿蛋白不仅在CSF中积累，在血液中的水平也与CSF高度相关。这为非侵入性检测ALS和FTD提供了新的可能性。在血液检测中，HDGFL2隐匿蛋白同样可以检测到，并且在C9orf72突变携带者中，疾病早期和晚期均可检测到显著水平的HDGFL2隐匿蛋白。血液和CSF中的HDGFL2隐匿蛋白水平高度相关，表明血液检测可以作为一种替代的非侵入性检测手段。
图6. 血液样本中检测HDGFL2隐匿蛋白的结果，显示血液和CSF中的HDGFL2隐匿蛋白水平高度相关。
结果讨论
研究团队解析了TDP-43蛋白剪接抑制丧失在ALS-FTD病理中的关键作用，发现这一过程在疾病早期阶段就开始，而非仅在终末阶段。研究显示，HDGFL2隐匿蛋白在ALS-FTD患者的CSF和血液中积累是TDP-43功能失调的早期标志。这与其他研究一致，支持TDP-43剪接抑制丧失是早期事件。HDGFL2隐匿蛋白在家族型和散发型ALS患者的CSF中表达水平显著升高，且早于神经丝轻链蛋白（NfL）和磷酸化神经丝重链蛋白（pNfH），具有高诊断敏感性。研究提出的模型显示，在疾病早期HDGFL2水平高于NfL和pNfH，而在疾病晚期则相反。此外，HDGFL2隐匿蛋白在血液中的水平与CSF高度相关，且在C9orf72突变携带者中疾病早期和晚期均可显著检测到，表明血液检测可以作为非侵入性替代手段。研究团队建议进行更大规模的纵向研究，以验证这些生物标志物在不同个体中的动态变化，并开发更高灵敏度的平台，如NULISA。这些生物标志物不仅对ALS-FTD诊断具有潜在价值，还可以用于区分阿尔茨海默病中的混合病因性痴呆，为不同治疗策略提供依据。总之，HDGFL2隐匿蛋白作为早期诊断和追踪ALS-FTD疾病进展的生物标志物，展示了重要潜力，有助于更早介入治疗并改善患者预后。
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作者丨张嘉闻
审稿丨杨树广、周峰泉
推文编辑 | 聂睿
