Cell
2024.05.23
段昕 | UCSF
研究背景
中枢神经系统（CNS）是生物体中最复杂和最精细的系统之一，其血管网络不仅在二维平面上展示出复杂的结构，还在三维空间中形成了高度有序的组织结构。这种高度有序的血管网络通过供应营养和氧气来维持神经元和其他细胞的正常代谢，因此对于CNS的正常功能至关重要。然而，尽管科学家们对二维血管生长有了相当深入的了解，但对于CNS中三维血管结构的形成机制仍然知之甚少。这个基本问题的解决不仅有助于我们理解CNS的发育和功能，还可能为治疗与血管异常相关的神经系统疾病提供新的思路。
2024年5月23日，加州大学旧金山分校（UCSF）段昕教授领衔的团队在Cell杂志发表封面文章 Perivascular Neurons Instruct Three-Dimensional Vascular Lattice Formation via Neurovascular Contacts。这项全新的研究揭示了中枢神经系统形态发生过程中一个非常基础的但是长久以来未曾揭示的问题：中枢神经系统血管发育如何从二维平面发育成三维（3D）点阵结构。在这篇研究中，研究团队以小鼠视网膜为模型系统，详细探讨了血管周神经元（Perivascular neurons）在CNS三维血管网络形成中的作用。小鼠视网膜是一个理想的研究模型，因为其结构简单且层次分明，同时具有透明的特点，便于观察和分析。研究发现了一类特定的血管周围神经元，即Fam19a4/Nts阳性视网膜神经节细胞（Fam19a4/Nts-RGCs），这些神经元通过与血管的直接物理接触，指导了三维血管点阵结构的形成。
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一种新的ooDSGC亚型：Fam19a4+ BR1-RGCs
首先，研究团队使用AAV2-BR1-GFP标记技术，发现了一种新的视网膜神经元亚型，这些神经元紧密分布在血管周围，通过其细胞体周围的端足与血管形成直接的物理接触（图1: A-E）。通过视网膜组织透明化，研究者发现AAV2-BR1-GFP所标记的神经元主要分布在血管附近，胞体与血管紧密并列，且位于血管垂直分支点。通过免疫组织染色，研究者将新发现的BR1-RGCs与已知的视网膜神经节细胞（RGCs）标记物进行了比较。结果表明BR1-RGCs具有平行排列的树突，并与OFF-ON无长突细胞（SACs）呈丛状分布，这种特性是ON-OFF方向选择性神经节细胞（ooDSGCs）的典型形态特征。然而，这些BR1-RGCs并不表达先前鉴定出的ooDSGC标记基因Cartpt或Cdh6。进一步通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析，研究者发现Fam19a4基因在这些BR1-RGCs中高度表达，而在其他已知的RGC亚型中则没有显著表达，这使得Fam19a4成为BR1-RGCs的一个特异性标记物（图1: F-L）。
图1
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Fam19a4/Nts-RGCs与血管内皮细胞（ECs）的相互作用
图3 A-D
PIEZO2 在Fam19a4/Nts-RGCs高度富集影响血管生成
那么是什么在介导Fam19a4/Nts-RGCs与血管相互作用呢？研究团队通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析发现，PIEZO2基因在Fam19a4/Nts-RGCs群体中表达水平最高，而在其他视网膜神经节细胞（RGC）群体中表达较低。为了确认这一发现，研究者们使用原位杂交技术进一步验证了PIEZO2转录本在Fam19a4/Nts-RGCs中的富集情况。结果显示，约79.2%的Fam19a4/Nts-RGCs表达PIEZO2，而在其他类型的RGC中则表达较少（图4A）。这种特异性表达提示，PIEZO2在这些神经元中可能扮演着独特的角色。
为了进一步探讨PIEZO2在血管生成中的作用，研究者们利用Nts-Cre系统和AAV2介导的基因敲除技术，特异性地删除了小鼠视网膜中的PIEZO2基因。结果发现，缺失PIEZO2基因的小鼠视网膜中，穿透血管的正常空间排列出现了显著的紊乱（图4K）。具体表现为血管的生长方向发生了改变，无法形成典型的柱状结构。这种紊乱的血管排列不仅影响了视网膜的血液灌注，还导致了视功能的受损。研究团队通过透射电子显微镜（TEM）观察到，PIEZO2基因缺失的小鼠视网膜中，Fam19a4/Nts-RGCs的端足与血管的直接接触显著减少（图4D）。这些结果表明，PIEZO2在Fam19a4/Nts-RGCs中对于维持血管的正常生长方向和结构至关重要。
为了进一步验证这些发现，研究者们对不同发育阶段的小鼠视网膜进行了详细观察。在P10和P30两个关键发育阶段，研究团队分别观察了Fam19a4/Nts-RGCs缺失对视网膜血管生成的影响。结果显示，在P10阶段，缺失Fam19a4/Nts-RGCs的小鼠视网膜中，穿透血管已经表现出明显的紊乱，血管的生长方向偏离，无法正确穿透不同的血管层（图5: B、F）。到了P30阶段，这种紊乱的血管结构更加明显，进一步证实了Fam19a4/Nts-RGCs在血管模式形成中的引导作用（图5: G、J）。
同时，研究者发现PIEZO2不仅在正常发育过程中发挥作用，在病理状态下也同样重要。为了验证这一点，研究团队通过模拟视网膜缺氧等病理条件，观察到缺失PIEZO2基因的小鼠视网膜对缺氧的耐受性显著降低，表现出更严重的视网膜损伤和功能障碍（图6: A-D）。这些结果表明，PIEZO2介导的神经元-血管相互作用不仅在正常发育过程中至关重要，还可能在应对病理挑战中发挥保护作用。
结果讨论
研究者通过使用多种实验技术，系统地揭示了Fam19a4/Nts-RGCs在视网膜三维血管网络形成中的关键作用，并深入探讨了PIEZO2基因在这一过程中所扮演的重要角色。这些发现不仅拓展了我们对中枢神经系统血管生成机制的理解，还为相关疾病的治疗提供了新的潜在靶点，体现了其科学和临床应用价值。
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作者丨余滋恺
审稿丨杨树广、周峰泉
推文编辑 | 聂睿
