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今天阿星给大家带来的这篇文章发表在Cancer Letters杂志上，影响因子高达9分。该文章结合了多种数据源，且设计合理具有创新性，综合利用了多种数据以及机器学习的方法，值得我们借鉴和学习。那么这篇文章的亮点主要都有哪些呢？阿星这就给大伙揭秘！
1.多种数据源结合：利用TCGA数据库中甲基化样本，UCSC Xena数据库中癌症类型数据，以及GEO数据库，通过综合分析使结果更加可靠。
2.多种方法融合：采用多组学分析结合机器学习的方法，分析甲基化数据，识别与干扰素相关的甲基化位点，构建了预测模型。
3.干湿实验结合：生信分析最后结合上相关细胞实验，验证基因的生物学功能，形成闭环使结果更具可信度。
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题目：通过多组学和单细胞转录组分析揭示PSMB9在黑色素瘤中的肿瘤抑制作用
杂志：Cancer Letters
影响因子：IF=9.1
发表时间：2024年1月
公众号回复“888”，即可领取原文献，文献编号为240820
研究背景
皮肤黑色素瘤是皮肤癌中的一种，近年来免疫疗法的突破使黑色素瘤的治疗方式发生了彻底变化，但肿瘤异质性仍然是一个难点。DNA甲基化引起的表观遗传修饰促进肿瘤发生，因此有可能揭示黑色素瘤的预后。本研究通过分析DNA甲基化和基因表达数据，构建鲁棒模型，综合分析结果表明，PSMB9是一个重要的预测标志物，具有潜在预测黑色素瘤免疫治疗反应的能力。
研究思路
本研究通过对基因组数据和临床信息的综合分析，探索了预测黑色素瘤患者免疫治疗反应的潜在标志物。首先分析了360827个甲基化探针和相应的25577个黑色素瘤患者的基因表达概况，区分了一种新的免疫亚型。利用机器学习方法分析甲基化数据，识别与干扰素相关的甲基化位点。然后，结合基因表达数据和临床信息建立预测模型，用于评估患者对免疫治疗的反应。在建模过程中，特别关注了关键基因PSMB9，研究其潜在的抗肿瘤作用，并进一步讨论PSMB9的临床意义。
图1 研究设计思路
研究结果
1.基于IFN相关基因的甲基化亚型鉴定及分析
本研究通过利用TCGA-SKCM数据库，分析了其中的472个DNA甲基化样本，基于干扰素相关基因将黑色素瘤分为了三个不同的亚型（图2A&B)，通过比较不同聚类间的DNA甲基化水平和差异甲基化位点（DMPs），以及对基因表达的影响。cluster2(C2)中几乎所有干扰素-γ相关基因表达上调（图2C)。C2的异常DNA甲基化状态表明了内在的癌症表型(图2D)。DMP在染色体中的分布显示在圆形曼哈顿图中(图2E)。通过Wilcoxon检验确定了高甲基化的C2在黑色素瘤中具有特定的DNA甲基化模式（图2F）。同时还发现54.75%的差异甲基化探针呈现低甲基化，而45.25%呈现高甲基化（图2G）。
图2 IFN基因相关甲基化亚型的构建
2.利用机器学习构建干扰素（IFN）甲基化特征
随后，研究使用了三种建模方法来获得鲁棒模型。首先采用单变量Cox回归过滤了DMP，并选择了所有p < 0.05的DMP进行下一步分析（图3A）。随后采用随机森林算法进行模拟训练，并根据变量重要性对探针进行选择和排序（图3B）。使用Lasso-Cox算法进行变量检索，选择了22个变量（图3C&D）。选取了10个探针（图3E），使用Lasso-Cox回归计算各探针的系数。将低于截断点的组定义为IFN阳性（IFN+）组。与IFN-组相比，IFN+组预后明显较好（图3F）。使用该模型对每个样本测量IFN甲基化评分（IMS）。IMS、年龄、Breslow深度、Clark IV和Clark V是黑色素瘤患者的风险因素（图3G）。IFN+群体的免疫细胞比例较高（图3H），且免疫反应途径如PD1、CTLA4、CTL和干扰素反应富集（图3I）。
图3 IFN+和IFN-群体在黑色素瘤患者中的分析
3.IMS在黑色素瘤治疗及泛癌分析中的预后价值
泛癌分析是理解IMS内在价值的一种新方法。研究将模型应用于TCGA-PANCANCER甲基化数据集。通过泛癌分析发现，在大部分癌症类型中IFN+组预后较好，只有极少部分癌症类型中IFN+组生存状况更差(图4A&B)。甲基化DNA干性指数(mDNAsi)是一种机器学习模型，可用于评估细胞的自我更新和分化能力。该研究计算了每种癌症类型的甲基化DNA干性指数，并比较了高危组和低危组之间的差异(图4C)。随后对不同的癌症类型之间进行了比较，为理解IMS的内在价值提供了新视角。
图4(A) 森林图展示了IMS在TCGA数据库中29种其他癌症类型中的预后价值。(B) 12种不同类型癌症的K-M生存曲线图。(C) 箱线图展示了33种癌症类型中甲基化DNA干性指数（mDNAsi）
4.PSMB9通过IFN-γ塑造黑色素瘤微环境
PSMB9基因是黑色素瘤患者预后和免疫检查点阻断（ICB）治疗中的一个关键因素。PSMB9可通过IFN-γ影响黑色素瘤的微环境。为了进一步探究PSMB9 在黑色素瘤中的作用，作者通过单细胞RNA测序分析了7186个细胞，并将它们分为了9个类别，分别是CD8+T细胞、CD4T细胞、B细胞、巨噬细胞、恶性肿瘤、恶性肿瘤2型、树突状细胞、癌症相关成纤维细胞和自然杀伤细胞（图5A&C）。发现PSMB9主要在T细胞和树突细胞中表达（图5B&C）。在恶性肿瘤细胞中，PSMB9只在某些仅在治疗前存在的亚型中表达（图5D&E&G）。通过对每种细胞类型中PSMB9表达水平的鉴定，PSMB9的高表达与免疫基因的激活相关联，如IFN-γ反应和NF-kB途径中的TNFa激活，以及MYC靶标的抑制（图5F）。
图5 单细胞RNA测序揭示了黑色素瘤微环境及PSMB9的作用
5.PSMB9参与IFN-γ信号传导并由转录因子驱动
PSMB9通过影响IFN-γ信号通路在黑色素瘤微环境中发挥作用，而这种作用受到转录因子的调控。作者使用NicheNet工具对恶性细胞与免疫细胞的相互作用进行分析，发现在PSMB9高表达组中，IFNG是最活跃的配体，主要由CD8+T细胞和树突状细胞分泌，揭示了PSMB9能够增加树突状细胞和T细胞中IFN-γ的表达（图6A&B）。通过pySCENIC转录因子分析，发现ETV5特异性靶向控制IFNGR2转录的恶性细胞；STAT1、EOMES和PRDM1是PSMB9的主要调控因子，主要存在于CD8T细胞（图6D）。此外，PSMB9的表达影响恶性细胞中的IFN-g受体IFNGR1和IFNGR2，这两种受体在单细胞水平的恶性细胞中均呈正相关（图7A&B）。在Bulk RNA seq色谱中，PSMB9与免疫标记基因如PD-L1和IFNG密切相关（图7C&D），这些均说明了PSMB9在免疫治疗反应中的重要性。
图6 细胞间相互作用和转录因子分析
图7 PSMB9与IFNGR1（A）和IFNGR2（B）的分布之间的相关性。IFNG（C）、PDL1（D）与PSMB9之间的相关散点图。（E）热图显示了异质细胞类型中独特的转录因子（TFs）
6.异常的PSMB9调节黑色素瘤细胞的增殖、克隆形成和细胞侵袭
在两种黑色素瘤细胞系SK-MEL-28和A375中过表达PSMB9，通过Western blotting检测结果显示，重组慢病毒在两种黑色素瘤细胞系中过表达（图8A），并通过RT-PCR证实了这一结论（图8B&C）。使用 CCK8细胞增殖实验证明过表达PSMB9 后，显著限制了细胞的增殖能力（图8D&E），并采用细胞克隆实验验证了这一结果（图8G）。肿瘤细胞的浸润影响恶性肿瘤的转移。因此该研究通过创伤愈合实验评估细胞迁移能力，过表达PSMB9降低了细胞迁移速度（图8F）。这些结果表明PSMB9在黑色素瘤中具有抑制其恶性程度和转移的作用。
图8 PSMB9的过表达降低了肿瘤细胞的增殖和迁移能力。
文章小结
该文章综合利用了肿瘤基因组学、转录组学和表观遗传学的数据，包括肿瘤组织样本、单细胞RNA测序数据和公共数据库中的数据。通过结合分析这些多种数据源，使结果更加可靠，且建立了一个可靠的预测模型，能够帮助评估患者对免疫治疗的反应，最后又结合湿实验冲上了1区9分+，是一篇非常值得借鉴的生信文章！如果你也想发一篇整合公共数据+湿实验的SCI就来找阿星吧，思路设计、生信分析和选题创新等难题阿星都能为你提供帮助，想要发高分就快快扫二维码与阿星探讨合作吧。
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20 August 2024
