肺炎支原体 (MP) 的检测方法有哪些？

学术 2024-12-18 12:11 天津

肺炎支原体 (M. pneumoniae，Mp) 是引起人类支原体肺炎的病原体，支原体肺炎占非典型肺炎的 1/3 以上，其病理变化以间质性肺炎为主。肺炎支原体感染呈世界性分布，但以温带地区为主。四季均可发病，以秋、冬季节多见，大流行很少，小流行可呈周期性发生，间隔时间为 3～5 年，平时多为散在发病。传染源为患者或带菌者，主要经飞沫传播，患者以儿童和青少年居多，多在学校、家庭中流行。

肺炎支原体主要侵犯呼吸系统，引发原发性非典型性肺炎。潜伏期 2～3 周，首先引起上呼吸道感染，然后下行引起气管炎、支气管炎、毛细支气管炎和肺炎。以隐性感染和轻型感染较常见，也可导致严重肺炎或伴发肺外组织、器官病变，如皮肤黏膜的斑丘疹、溶血性贫血、心肌炎、心包炎、脑膜炎或脑炎等。此外，致病性也与迟发性超敏反应有关。

生物学特性

1. 形态染色

肺炎支原体无细胞壁，最外层为细胞膜，呈高度多形态性，主要为丝状，长 2～5 um 在丝状体尖端有一特殊球状结构，有时可见球形或双球形的菌体，革兰染色镜检阴性，但不易着色，姬姆萨染色呈淡紫色。

2. 培养特性

对低渗透压敏感。营养需求高于一般细菌，培养基中必须添加 10%～20% 的人或动物血清，初次分离培养时尚需添加 10% 的新鲜酵母浸液。最适 pH 值为 7.8～8.0，pH 值 7.0 以下可致其死亡。5% CO₂ 条件下生长最好，最适生长温度为 36～37 ℃。

支原体生长缓慢，在液体培养基中有极微弱的混浊，在固体培养基上孵育 5～7 天后出现菌落。肺炎支原体的菌落较大，直径为 10～100 μm。初次分离时为细小颗粒状菌落，多次传代后形成典型「油煎蛋」样菌落，菌落中心较厚，向下长人培养基中，周边为一层薄而透明的颗粒区。菌落能吸附豚鼠红细胞；能产生溶血素，可迅速而完全地溶解哺乳动物红细胞。半固体培养基中呈现肉眼可见的细小粒状菌落。

3. 生化反应

肺炎支原体分解葡萄糖产酸，不分解精氨酸，尿素试验阴性。

4. 抗原与分型

支原体无细胞壁，其抗原性主要取决于细胞膜上的蛋白质和糖脂。糖脂的抗原性很强，但特异性较差，与多种其他支原体、细菌（如肺炎链球菌 23 型及 32 型、MG 链球菌）及宿主细胞（如人红细胞 I 型抗原）有共同的抗原决定簇。

所有肺炎支原体均具有分子质量为 1.7X10⁵ Da 的 P1 外膜蛋白和 4.3X10⁴ Da 的菌体蛋白，特异性强，可刺激机体产生持久的高效价抗体。肺炎支原体 P1 外膜蛋白是支原体的主要型特异性抗原，其抗原性可用 GIT 与 MIT 进行鉴定，通过该试验可将肺炎支原体分成若干血清型。部分肺炎支原体菌株在细胞膜外还有一层荚膜，主要成分是多糖，也具有一定的抗原性。

5. 抵抗力

4 ℃ 放置不超过 3 天，56 ℃ 很快被灭活。对热于燥非常敏感，冻干能长期保存。因无细胞壁，对青霉素、头菌素等作用于细胞壁的抗生素不敏感，故常在分离培养中加人青霉素。对脂溶剂、去垢剂苯酚和甲醛等常用消毒剂敏感。

检测方法

肺炎病原体培养虽然作为金标准，但临床应用难度大。肺炎支原体、衣原体抗原或抗体检测，优点是耗时短，但灵敏度低，且疾病早期不易检出阳性。核酸检测在肺炎的病原诊断上具备一定优势，灵敏度高、特异性高、不受抗菌药物应用影响；对比分离培养，简便快速、缩短报告时间、满足临床时效性的需求，对比抗体，检测窗口期短，满足早期快速检测需求。

1. 标本采集

可采集患者痰液、咽拭子、鼻咽洗液、支气管洗液，血清标本等，肺炎支原体有黏附细胞作用，故以咽拭子标本为好。取材后应立即接种，或置转运培养基（蔗糖磷酸盐缓冲溶液）中，组织块应切碎或研磨后再接种。培养基中加入青霉素可抑制杂菌的生长。

2. 标本直接检查

2.1. 显微镜检查

革兰染色阴性，但不易着色。电镜下观察无细胞壁，可与细菌鉴别。

2.2. 核酸检测

PCR 检测主要包括普通 PCR 实时荧光定量 PCR 及巢氏 PCR 等，目前临床上以荧光定量 PCR 开展最为广泛。

3. 分离培养与鉴定

3.1. 分离培养

常采用 Hayflick 固体或液体培养基（以牛心消化液为基础，另加人小牛血清、新鲜酵母浸液、抑菌剂等）。在培养基中加人醋酸铊、青霉素可抑制杂菌生长。初次分离培养时生长缓慢，通常先将标本接种于含葡萄糖、酚红和亚甲蓝指示剂的液体培养基中增菌，1 周后培养基由紫色变为绿色液体清晰，可考虑有肺炎支原体生长，此时可转种于固体培养基上，于 5% CO₂，环境下培养。初次分离一般 1～2 周长出致密圆形的菌落，经数次传代后可出现典型「油煎蛋」样菌落。肺炎支原体分离培养的阳性率不高，且耗时长，故对临床快速诊断意义不大，但对流行病学调查有重要意义。

3.2. 鉴定

肺炎支原体分解葡萄糖产酸，不利用精氨酸和尿素。在分离培养过程中，若呼吸道标本使含葡萄糖培养基 pH 缓慢降低，指示剂颜色随之改变，或生长的菌落发生红细胞吸附等，即可初步定，推测标本中存在肺炎支原体。

若在固体培养基上生长出典型「油煎蛋」样菌落，表明标本中有支原体生长，可疑菌落需根据其菌落特征、染色后镜检、生化反应以及 GIT、MIT 等血清学方法进行鉴定。

4. 抗体检测

抗体检测是目前检测支原体感染的主要手段，包括非特异性抗体检测和特异性抗体检测。

4.1. 非特异性抗体检测

主要采用冷凝集素试验。冷凝集素是人感染肺炎支原体后产生的一种 IgM 型自身抗体，4 ℃ 条件下可凝集人的 O 型红细胞，约 50% 的患者于发病后 1 周末或第 2 周初开始呈阳性反应（抗体效价不小于 1:64）。因该抗体也可见于流感病毒或腺病毒感染、溶血性贫血、传染性单核细胞增多症等，少数健康者也可呈阳性反应，故渐被特异性抗体检测方法所取代。

4.2. 特异性抗体检测

主要有 ELISA、间接荧光免疫法、明胶颗粒凝集法、补体结合试验等检测肺炎支原体 IgM 或 IgG 抗体。ELISA 法快速、经济、敏感特异性高，采用分子质量为 1.7X10⁵ Da 的 P1 蛋白和分子质量为 4.3X10⁴ Da 的多肤检测相应抗体，是目前诊断肺炎支原体感染最常用的血清学方法。

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