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1、这篇文章首先确定了N4-乙酰胞嘧啶（ac4C）乙酰化的关键酶NAT10在人骨肉瘤组织中高度表达，其敲除增强了m6A含量并显着抑制了骨肉瘤细胞的生长、迁移和侵袭；

2、本文的创新性主要在于：①首次证明ac4C驱动的RNA m6A修饰可以正向调节癌细胞的糖酵解，并揭示了骨肉瘤中NAT10/ac4C-YTHDC1/m6A-LDHA/PFKM以前未被识别的信号轴；②首次揭示了NAT10介导的YTHDC1 mRNA衰变部分是由于其mRNA转录本的稳定性降低，导致蛋白质翻译的抑制和骨肉瘤细胞生长的抑制。（ps：不是别人文章发的容易，而是小伙伴们还没遇到“天命人”！大海哥这不就来啦~想要相关热点方向的课题设计评估和生信分析小伙伴们速来扫码联系大海哥吧！羡慕已经说腻了，不如即刻扫码“逆风翻盘”吧~）

题目：NAT10介导的ac4C乙酰化驱动的m⁶A修饰通过参与YTHDC1-LDHA/PFKM调节糖酵解并促进骨肉瘤    

杂志：Cell Communication and Signaling

影响因子：IF=8.2

发表时间：2024年1月

研究背景

骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤，其特征是高度恶性肿瘤和不良预后，转移后的5年生存率低于20% 。因此，探索骨肉瘤发展和进展的分子机制对于开发新的治疗策略至关重要。RNA N6-甲基腺苷（m6A）在癌症进展过程中的动态变化参与各种细胞过程。然而，关于上游调节因子与m6A修饰之间可能的直接联系知之甚少，因此会影响致癌进展。

研究思路

研究结果

1.Ac4C调节YTHDC1的mRNA稳定性和翻译    

如图1A所示，通过qRT-PCR证实了NAT10 siRNA在U2OS和143B细胞中的转染效率。RNA斑点印迹结果显示，转染NAT10 siRNA后，骨肉瘤细胞中ac4C含量显著降低。Elisa检测显示出m6A含量的变化，与NC组相比，敲除NAT10后的m6A含量显著增加。接下来，研究者们用PACES预测了YTHDC1 mRNA中的ac4C乙酰化位点。用qRT-PCR检测NAT10后U2OS和143B骨肉瘤细胞系中YTHDC1TemRNA的表达水平。此外对YTHDC1进行了基因特异性ac4C qPCR，证实了YTHDC1转录本中ac4C水平的降低。为了进一步探索NAT10调控YTHDC1转录本表达的潜在机制，研究者发现在143B细胞中，与siNC组相比，在存在转录抑制剂放线菌素D（行为D）时，siNAT10抑制了YTHDC1 mRNA的稳定性。同时，在翻译抑制剂环己酰亚胺（CHX）的存在下，siNAT10加速了YTHDC1的降解，NAT10沉默确实导致YTHDC1转录本的半衰期显著降低。

图1 Ac4C调节mRNA稳定性和YTHDC1的翻译    

2.NAT10依赖性ac4C乙酰化影响骨肉瘤细胞的生长和运动

与正常骨组织相比，NAT10蛋白的表达明显高于正常骨组织。来自TCGA数据集的Kaplan-Meier生存分析显示，NAT10低表达的肉瘤患者表现出较高的生存率，而NAT10高表达的肉瘤患者表现出较差的生存率。接着检测了NAT10对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果显示，NAT10的缺失降低了U2OS和143B骨肉瘤细胞的集落形成能力。此外，在EdU染色、transwell细胞侵袭和伤口愈合细胞迁移实验中，下调NAT10显著抑制了U2OS和143B细胞的增殖、侵袭和迁移能力。结果表明，NAT10在体外影响细胞增殖、迁移和血管生成。

图2 NAT10依赖性ac4C乙酰化影响骨肉瘤细胞的生长和运动

3.Ac4C乙酰化调节骨肉瘤细胞的糖酵解

与先前预期相吻合，当在143B及U2OS细胞内实施NAT10的敲除操作时，观察到葡萄糖浓度显著上升，而乳酸与丙酮酸的生成量则普遍呈现下降趋势。进一步通过qRT-PCR技术分析，揭示了在上述两种细胞中，NAT10的缺失导致了与糖酵解途径紧密相关的基因，特别是PFKM与LDHA，其mRNA表达水平发生了不同程度的下调。随后，在蛋白质层面进行的验证实验也确认了PFKM与LDH活性的相应减少，与mRNA水平变化一致。这些综合发现强调了NAT10作为ac4C乙酰化的关键酶，在介导骨肉瘤细胞的糖酵解中发挥作用。    

图3 ac4C乙酰化调节骨肉瘤细胞的糖酵解

4.YTHDC1介导的m6A甲基化影响骨肉瘤细胞生长并调节糖酵解途径

基于TCGA数据库的信息，Kaplan-Meier生存分析揭示了YTHDC1基因的低表达状态与肉瘤患者预后改善之间的显著关联。研究团队进一步在mRNA转录及蛋白质层面确认了YTHDC1表达抑制的效率。值得注意的是，在U2OS与143B骨肉瘤细胞模型中，YTHDC1的敲除操作显著遏制了细胞的生长速率、增殖能力及迁移活性。尤为引人关注的是，当YTHDC1被敲除后，对细胞培养环境中葡萄糖残余量及细胞内乳酸、丙酮酸浓度的检测结果显示出与假设相符的变化趋势。具体而言，与siNC对照组相比，143B与U2OS细胞在YTHDC1缺失条件下，乳酸生成量与丙酮酸含量均有所减少。同时，这两种细胞系在YTHDC1表达下调后，均展现出增强的葡萄糖摄取能力。综上所述，这些发现表明，NAT10通过YTHDC1介导的m6A甲基化影响骨肉瘤细胞的生长，并调节糖酵解途径。    

图4 YTHDC1介导的m6A甲基化影响骨肉瘤细胞生长并调节糖酵解途径

5.YTHDC1识别PFKM和LDHA RNA上的差异m6A

随后，利用序列导向的SRAMP工具预测m6A修饰位点，识别出PFKM与LDHA基因的mRNA序列中存在多个潜在的m6A修饰候选位点。通过RIP-PCR实验验证，确认了PFKM和LDHA能够特异性地与YTHDC1蛋白发生相互作用。进一步地，在143B和U2OS细胞系中，YTHDC1不仅在mRNA层面，也在蛋白质层面有效抑制了PFKM和LDHA的表达。为了深入探究YTHDC1调控PFKM和LDHA表达的分子机制，研究团队采用了放线菌素D（Act D）及蛋白合成阻断剂放线菌素CHX，分别处理正常对照（NC）与YTHDC1敲除的143B细胞，并量化了PFKM和LDHA转录本的半衰期及其mRNA的稳定性。结果显示，YTHDC1的沉默显著缩短了这两种转录本的半衰期，这一发现强调了YTHDC1在识别PFKM和LDHA RNA上的双向m6A修饰中的关键作用，进而影响了它们的稳定性及后续的翻译效率。    

图5 YTHDC1识别PFKM和LDHA RNA上的差异 m6A

6.YTHDC1部分消除了NAT10敲低对体内肿瘤生长的抑制作用

为了获得更确凿的证据，证明NAT10和YTHDC1对肿瘤生长的影响，研究者们通过慢病毒转染143B细胞构建了稳定的NAT10敲除和对照细胞。一部分NAT10敲低细胞也转染了YTHDC1过表达的慢病毒，并用于建立动物异种移植模型。通过WB分析证实shNAT10和YTHDC1的慢病毒感染效率。结果表明，与转染空慢病毒衍生的小鼠相比，接种慢病毒稳定NAT10敲低细胞的小鼠的肿瘤体积和癌组织重量显着降低。同样，不同治疗组的苏木精和伊红（H&E）染色也进一步支持了这些治疗效果。研究发现，在转录抑制剂放线菌素D存在的情况下，慢病毒过表达YTHDC1部分消除了慢病毒消耗NAT10导致的其稳定性降低（ActD）。慢病毒过表达YTHDC1部分消除了lenti-shNAT10敲低导致的YTHDC1 mRNA和蛋白的稳定性降低。此外，在集落形成实验中，慢病毒消耗NAT10显著抑制了U2OS和143B骨肉瘤细胞的集落形成能力，慢病毒过表达YTHDC1显著消除了这种缺陷。    

图6 YTHDC1部分消除了NAT10敲低对体内肿瘤生长的抑制作用

文章小结

总之，本研究：①将ac4C乙酰化修饰与m6A甲基化修饰联系起来，为人类癌症的表观遗传调控提供了新的见解；②表明ac4C驱动的RNA m6A修饰在骨肉瘤发展中的关键作用，其特征是诱导骨肉瘤细胞中的糖酵解过程；③揭示了骨肉瘤中NAT10/ac4C-YTHDC1/m6A-LDHA/PFKM以前未识别的信号轴，表明重编程RNA m6A甲基化是骨肉瘤治疗的潜在且有前途的策略，并为骨肉瘤发展的分子机制提供了深刻的见解。对相关的研究热点和思路感兴趣的宝子们快来扫描下方二维码联系大海哥吧！有了大海哥专业加成，人人都能看好你，偏偏你又最争气，早发刊早享受~