摘要：腺病毒已成为研究病毒-细胞相互作用和发现不同细胞过程的模型，例如RNA剪接和DNA复制。此外，作为疫苗和基因治疗的病毒载体的发展和评估，已经促使对腺病毒生物学进行了详细的研究，包括腺病毒编码蛋白的结构和功能。虽然腺病毒生物学中病毒衣壳蛋白的结构和功能已经被众多报告所确定，但近年来，对阐明腺病毒核心蛋白的结构和功能的兴趣日益增加。在这里，我们提供了关于腺病毒核心蛋白在腺病毒生物学中结构和功能研究的综述。
1.引言
腺病毒（AdVs）是不包膜的二十面体病毒，具有双链DNA基因组。自1953年发现以来，在人类、哺乳动物、鸟类、鱼类和爬行动物中已鉴定出超过120种特异性腺病毒血清型。尽管人类腺病毒通常不与免疫正常人体中引起严重疾病相关，但它们可能在免疫受损人群中引起严重感染。相比之下，动物腺病毒似乎与动物和鸟类的临床重要疾病相关。腺病毒大小约为65-90纳米，具有复杂的结构组织，已被归类为Adenoviridae家族中的六个属。Adenoviridae家族中的病毒包含一个26到48 kb的非分段线性双链DNA基因组，该基因组在感染后的不同时间转录，产生的转录本被分类为早期（E）、中间（I）和晚期（L）区域。晚期（L）区域编码结构和非结构蛋白，这些蛋白参与衣壳形成、DNA包装和后代腺病毒病毒粒子的成熟（图1A）。Mastadenovirus（mAdV）属的成员包含属特异性蛋白（蛋白IX和蛋白V）或与其他Adenoviridae家族属成员共享的蛋白（DNA聚合酶（pol）、末端蛋白（TP）、DNA结合蛋白（DBP）、52K、蛋白（p）IVa2、pIIIa、pIII、pVII、pX、pVI、六角蛋白、蛋白酶、100K、33K、pVIII和纤维蛋白）（图1A）。mAdV病毒衣壳包围着病毒核心，由主要（五边形、六角蛋白、纤维蛋白）和次要（pIX、pIIIa、pVI和pVIII）衣壳蛋白组成（图1B），这些蛋白在稳定涉及蛋白-蛋白相互作用的病毒结构中发挥重要作用。
图1.(A) 犸斯塔腺病毒（牛腺病毒-3）基因组的示意图。两条线表示DNA链。顶部的数字显示碱基对数（BP）。箭头显示转录/翻译的方向。核心蛋白以绿色表示。AVP-腺病毒蛋白酶；DBP_DNA结合蛋白；POLDNA聚合酶；E-早期；L-晚期。(B) 腺病毒结构：基于晶体学和冷冻电镜的腺病毒粒子横截面的示意图。AVP-腺病毒蛋白酶；TP末端蛋白酶；p-蛋白。
2.mAdV核心蛋白
二十面体DNA和RNA病毒的病毒核心由与核酸相关的蛋白质组成。mAdV的核心包含基因组DNA和核心蛋白pVII、pV、Mu(pX)、pIVa2、末端蛋白(TP)和腺病毒编码的蛋白酶(图1)。末端蛋白附着在每个基因组片段的5'末端，并参与DNA复制。腺病毒蛋白酶非特异性地结合基因组DNA，并参与某些腺病毒前体蛋白的切割。腺病毒IVa2是一种中间蛋白，由于其在病毒粒子内部的位置，被认为是核心蛋白。多肽VII、V和X(Mu)是mAdV核心核蛋白复合物的主要组成部分，并被认为是主要的DNA凝聚蛋白，负责约50%的核心分子量。它们富含碱性氨基酸，这带来了正电荷，因此强烈结合到带负电的dsDNA上。这有助于将病毒基因组压缩以适应衣壳内有限的空间，这在(a)防止病毒DNA被宿主免疫系统识别和(b)维持病毒粒子的内部压力以及从破坏的病毒粒子中释放DNA中显得至关重要。Mart´ın-Gonz´alez等人将腺病毒核心解释为纤维和斑点结构的混合物。基于冷冻电镜断层扫描与分子动力学模拟分析提出的模型表明，腺病毒核心看起来像几个腺病毒体亚单位(柔软的球体，像珠子一样排列在一串中，腺病毒体之间的DNA空间，形成粗纤维状结构)，由DNA和凝聚蛋白不对称分布组成。除了在腺病毒生命周期中发挥重要作用外，一些病毒核心蛋白还被用作工具(a)传递肽疫苗抗原，(b)识别病毒衣壳和核心在核内的积累位置，以及(c)定量腺病毒病毒粒子。
2.1.蛋白VII(pVII)
2.1.1.一般特性
mAdV的L2区域编码pVII，它负责大约10%的病毒粒子质量。由mAdV成员编码的pVII同源物的N-端50个氨基酸看起来高度保守。pVII是一种高度碱性蛋白，富含精氨酸(23%)和丙氨酸(19%)残基。大约46%的pVII氨基酸是带正电荷的或高度阳离子的，这使它对DNA的带负电的磷酸骨架具有吸引力。对蛋白质的二级结构分析预测了pVII的两个螺旋-环-螺旋域，由N-端和C-端的扩展β-片层所环绕。虽然这些螺旋之间的疏水相互作用允许pVII链内折叠，赋予它三级结构，但碱性域仍然与基因组DNA的磷酸基相互作用，表现出pVII作为核小体样颗粒，由腺病毒染色质中的较大同源寡聚体组成。pVII单体在它们的核输入之前被寡聚化。有趣的是，冷冻电镜(cryo-EM)对AdV-5(HAdV-5)的分析在3.2埃分辨率下表明，在六角体的内腔中存在一个被切割的pVII片段(氨基酸14到24)，这通过质谱分析得到了确认。串联质谱分析pVII检测到两个乙酰化位点在保守的赖氨酸残基上，以及三个磷酸化位点，这可能负责pVII与细胞染色质的相互作用，并在病毒复制期间发挥重要作用。有趣的是，pVII被病毒蛋白酶蛋白水解切割，识别一个非共识切割位点在残基13-14之间释放肽pVIIN1(N-端残基1-13)和一个共识切割位点(M/LXGG↓X)在残基24和25之间释放肽pVIIN2(N-端残基14-24被释放)。虽然未切割的pVII在未成熟病毒中被检测到，但只有切割的pVII(pVIIN2)在成熟病毒中被检测到。此外，细胞cullin-3 E3泛素连接酶复合物与前体肽(氨基酸1-24的pVII)的相互作用增加了pVII的稳定性。前体肽序列和pVII的赖氨酸残基在氨基酸26和27上的功能相互依赖，为pVII提供稳定性。pVII定位于不同的亚细胞结构，包括细胞核、核仁和线粒体。pVII通过活性转运利用核定位信号(NLSs)和importin α/β和transportin核输入途径定位到细胞核。尽管对HAdV-5 pVII的生物信息学分析预测氨基酸90-113和氨基酸141-158作为潜在的NLSs，但NLSs的确切位置的揭示一直难以捉摸。尽管对HAdV-5突变体pVII蛋白的分析表明，存在经典(99KRRRRR104)和两个重叠的潜在双分部NLSs(127RARR130-X10-141RR142-X10-153RSRRR157)和非经典(188RVPVRTRPPRN198)NLS，这些区域的点突变并没有消除pVII的核定位，表明pVII使用的NLS(s)的性质看起来复杂。然而，似乎未切割的pVII特异性地与importin-α、importin-β、importin α-7和transportin相互作用，而切割的pVII只特异性地与transportin相互作用。有趣的是，只有未切割的pVII由于存在核仁定位信号而定位于核仁。由牛腺病毒-3(BAdV-3)表达的pVII也使用其自己的线粒体定位信号(MLS)定位于线粒体，该信号位于N-端氨基酸1-54。
2.1.2.功能
与病毒基因组相关的切割型pVII介导病毒基因组的核运输。进入的病毒DNA-蛋白核心在宿主微管-动力蛋白依赖机制的帮助下运输到核孔复合体(NPC)，并通过Nup214的N-端与部分解聚病毒的六角蛋白结合而停靠在NPC。解聚后，病毒基因组的核运输似乎是由与基因组相关的pVII进口途径介导，利用多个核进口受体。因此，pVII似乎作为病毒基因组核运输的适配器。最近的一份报告表明，Nup358有助于在NPC附近形成和增加不同的核进口受体，允许腺病毒基因组利用pVII介导的核进口途径。
许多报告表明，pVII与DNA和细胞蛋白相互作用以调节病毒生命周期。人们普遍认为pVII是细胞组蛋白(H)的功能类似物。H4是组蛋白的一个亚单位，会被乙酰化和磷酸化。尽管H4亚单位和pVII在结构上没有太多相似性，但这两种蛋白质a)包含基本残基的非随机分布，b)似乎被乙酰化和磷酸化，并包含1:1的蛋白质-DNA质量比。有趣的是，pVII在功能上模仿细胞精蛋白，这是一种富含精氨酸的核蛋白，在精子形成过程中取代组蛋白以进行精子头部的DNA凝聚。与精蛋白不同，蛋白VII与核小体相互作用，但不会从核小体中取代组蛋白。进入的切割型pVII结合到AdV DNA在防止抗病毒免疫反应的诱导中起着重要作用，这对于感染细胞中病毒的有效复制至关重要。在炎症反应中，高迁移率族蛋白B (HMGB)蛋白1，HMBG B组蛋白的成员之一，被释放并作为危险信号激活宿主细胞中的免疫反应。值得注意的是，与腺病毒DNA结合的切割型pVII在细胞核中与HMGB1结合并防止其从细胞染色质中释放，从而帮助逃避宿主细胞防御机制的诱导。此外，在腺病毒感染的初始阶段，pVII掩盖了AdV DNA末端，防止DNA损伤响应传感器MRN (Mre11-Rad50-Nbs1)复合体识别AdV DNA末端，从而有助于有效的病毒DNA复制。同样，pVII与SPOC1 (卵巢癌中与存活时间相关的PHD蛋白1)相互作用，SPOC1是一种与染色质相关的因子，参与DNA损伤响应并在感染的早期阶段限制腺病毒基因转录，并防止识别和检测病毒dsDNA。最近的报告表明，pVII可能间接参与病毒-细胞相互作用的早期阶段。AdV复制的成功完成需要有效的进入和随后从内体内的部分解包AdV的释放。众所周知，内体酸化和内体膜的破裂(pVI的裂解部分pVIn)有助于将部分解包的腺病毒病毒粒子从内体释放到细胞质中。早期研究表明，N-端切割型pVII片段(pVIIN2)的第22个氨基酸(包含氨基酸14至24)似乎与切割型pVI的N-端第23个氨基酸(pVIN)竞争与每个六角体的相同结合位点[32]。pVII(每个病毒粒子500-800个副本)和pVI(每个病毒粒子360个副本)对六角体上的相同结合位点(每个病毒粒子720个位点)的激烈竞争导致pVI的可用性较少，从而通过AdV蛋白酶的蛋白水解切割，暴露N-端pVI裂解肽(pVIn)与内体膜相互作用，导致腺病毒成功从内体逃逸。缺乏pVII的腺病毒从内体逃逸效率低下，导致推测pVII可能在感染的早期阶段直接作用或通过改变核心和衣壳蛋白之间的相互作用间接作用。最近的发现表明，缺乏pVII的腺病毒从内体逃逸效率低下是由于AdV蛋白酶无法切割pVI，pVI仍然隐藏在六角体腔中(由于六角体上有更多的结合位点)，因此放弃了内体中pVI裂解肽与内体膜相互作用的可用性。腺病毒基因组转录在时间上受到调节，因为AdV基因组的不同区域在感染后的不同时间转录。腺病毒pVII参与促进腺病毒早期基因的转录。一旦pVII-DNA复合体进入细胞核，pVII仍然与病毒DNA相关联，并作为强大的转录抑制因子。在感染的早期阶段，蛋白VII似乎与细胞磷酸蛋白32 (pp32)结合，并与病毒染色质形成复合体；然而，p32在体外似乎并不重塑腺病毒基因组。pVII与病毒DNA结合并与宿主因子SET/TAF I (模板激活因子)相互作用，形成DNA-pVII-TAF1三元复合体。这种复合体的形成导致腺病毒基因组的重塑，从而促进和增强E1A转录。E1A转录本似乎释放了基因组上的pVII，逆转了转录抑制。pVII从基因组的释放和pVII与E1A的N-端相互作用增强了其他早期基因的转录。在腺病毒感染期间，pVII可能防止细胞组蛋白在新复制的病毒基因组上的随机沉积，以避免对转录活性产生负面影响。然而，在病毒感染后期，新合成的pVII与TAF-III (核磷蛋白/B23/NPM1)结合到腺病毒DNA上，似乎重塑了感染细胞中的病毒染色质。后来，细胞锌指蛋白622 (ZNF 622)似乎与pVII和TAF-III相互作用，形成三元复合体，限制了pVII与病毒基因组的结合，并阻碍了病毒复制。AdV pVII参与在AdV衣壳中凝聚基因组DNA。未切割的pVII与AdV基因组相互作用，与DNA和组蛋白形成复合体，将双链DNA组织成凝聚的腺病毒核心，大约有180个核小体。这将26-48 kb的AdV基因组压缩在90-100 nm的二十面体衣壳中，使AdV核心成为一个受压和牢固的结构。切割型pVII的基本性质直接负责核心的刚度和压力以及衣壳的硬度。最近的一份报告支持早期提出的后代病毒形成的共组装机制，并提出，当双链基因组被蛋白VII和其他核心蛋白凝聚时，pVII的N-端(氨基酸1-24)作为锚点组装衣壳体，这在成熟阶段被切除，留下没有衣壳的凝聚基因组核心。尽管pVII以序列独立的方式结合到ds DNA上，并且可以凝聚病毒基因组，但它对病毒衣壳中病毒DNA的凝聚并不是必需的。此外，正如之前基于pVII与pVIa2和p52/55k的相互作用所推测的，pVII对基因组包装或病毒组装并不是必需的。
pVII似乎直接或间接参与了一些病毒蛋白的蛋白水解切割。成熟后代病毒粒子生产的最后步骤是腺病毒蛋白酶对AdV蛋白VI、VII、VIII、IIIa、TP、X和52/55K前体的切割。在缺乏pVII的情况下，这些蛋白质中特别是pVI的蛋白水解切割似乎有缺陷，这导致了pVII可能通过改变AdV蛋白酶活性来影响pVI的蛋白水解切割。
其他报告表明，pVII可能通过抑制凋亡或消除细胞蛋白的抑制作用来促进后代病毒的有效生产。pVII定位于线粒体，这有助于通过保留线粒体Ca2+、增加线粒体ATP水平和维持转染细胞的膜电位(MMP)来抑制凋亡。此外，未切割的pVII与CCCH型锌指蛋白细胞Makorin环指蛋白1(MKRN1；E3泛素连接酶)相互作用，并与未知的细胞因子一起增强MKRN1自我泛素化，随后在感染细胞中通过蛋白酶体降解MKRN1，这可能有助于有效病毒生产。
pVII还报道与pIVa2、p52/55 kDa、六角蛋白、pV和pIIIa相互作用，但这些相互作用的生物学意义尚不清楚。
2.2.蛋白V (pV)
2.2.1.一般特性
蛋白V (pV)是仅由mAdV属成员编码的独特蛋白。pV类似于细胞组蛋白，本质上是高度碱性的，含有高精氨酸和赖氨酸残基。pV。pV是第二丰富的核心蛋白；然而，pV与最丰富的核心蛋白pVII的相对浓度已报告分别为1:6和1:3.5。每个病毒粒子包含148 ± 15份pV。
病毒衣壳的晶体分析表明，pV具有扩展结构，包含两个短肽螺旋(氨基酸208-219和氨基酸259-271)。涉及病毒粒子的交联研究表明，pV在单体-二聚体平衡中以可溶形式出现。pV在其氨基末端被乙酰化，并且是宿主SUMOylation机制的靶标，这似乎调节病毒复制效率。
一旦感染性mAdV内化目标细胞，衣壳的脱壳就会逐步进行。早期报告表明，附着在含有DNA的病毒核心上的pV或与细胞p32相关联的pV进入细胞核。然而，最近的报告表明，尽管pV与进入的病毒基因组结合，但它在腺病毒核心进入细胞质时部分从病毒中解离，并在核孔复合体不进入细胞核。相比之下，新合成的pV在其自身的核定位信号(NLSs)的帮助下，利用α/β核输入受体介导的核运输机制积极运输到细胞核。
尽管许多研究报告了存在单分部和/或双分部NLSs，但pV编码的不同mAdV的NLSs的位置和用于pV核运输的核受体可能不同。
包括AdV在内的一些病毒的有效复制会诱导核仁发生改变，这需要病毒蛋白定位到核仁。有趣的是，pV也定位于感染和转染细胞的核仁，尽管pV不会在核仁中积累。缺失突变分析表明，由不同mAdVs编码的pV包含两个独立的核仁定位基序，这些基序似乎是功能冗余的，并可能利用运输蛋白进行核仁定位。有趣的是，稳定感染性病毒粒子的生产需要两个NoLSs的存在。虽然HAdV-5 pV的核仁定位诱导了B23.1和核仁素在短暂过表达转染细胞中的转位，但BAdV-3 pV的核仁定位在感染/转染细胞中不会改变B23.1或核仁素的核仁分布。值得注意的是，由mAdVs编码的pV似乎包含非重叠和重叠的NLS/NoLS。
2.2.2.功能
早期报告表明pV和pVII可能都涉及将病毒基因组转移到细胞核。然而，一些观察结果表明pV可能不与病毒DNA的核输入相关。首先，pV与pVII-DNA的相互作用似乎不强。其次，pV似乎在病毒基因组的核定位之前完全从腺病毒染色质中解离。第三，在pV缺失的AdV中，病毒基因组仍然转移到细胞核，表明pV对腺病毒基因组的核定位并非必需。
在缺乏pV的情况下，AdV产生热敏感的后代病毒粒子，形态和感染性发生改变，表明pV可能有助于产生稳定的后代病毒粒子。实际上，pV似乎通过与其他病毒蛋白和DNA相互作用，作为病毒染色质-病毒核心和病毒核心-病毒衣壳之间的桥接因子。pV的单体和二聚体可能都参与这些感染细胞中的相互作用。pV富含基本氨基酸的N-端似乎在多个位点与病毒DNA相互作用，这些位点似乎是热稳定的。pV与病毒DNA的结合为结合其他病毒蛋白（如pVII和Mu）留下了几个区域。最近的报告表明BAdV-3 pV与少数核心蛋白pIVa2相互作用，这可能有助于稳定病毒DNA与病毒核心之间的桥接。
pV与其他衣壳蛋白相互作用，并作为病毒核心和病毒衣壳之间的桥接。pV的C-端（氨基酸289–295）与少数衣壳蛋白pVI（氨基酸103–115）相互作用，形成病毒核心和衣壳之间的桥接。此外，pV与另一个少数衣壳蛋白pVIII的C-端相互作用。因此，pV、pVI和pVIII之间的相互作用形成一个复合体，将周边五边形与相邻的九个六边形粘合在一起。然而，晶体结构分析揭示pV并不直接与六边形相互作用。
除了通过桥接病毒DNA、病毒核心和病毒衣壳来稳定病毒粒子外，pV似乎也是腺病毒在原代细胞中复制所必需的蛋白，但在癌细胞中则不是。与HAdV-5[80]不同，BAdV-3 pV在原代和连续细胞系中对病毒复制似乎至关重要。此外，BAdV-3 pV的缺失并未在pX/Mu或pVII中引入补偿性突变。虽然pV的缺失似乎不影响早期蛋白的表达，但感染细胞中一些晚期蛋白的表达发生了变化，表明pV可能参与了晚期基因表达的调节。
pV高度碱性的N-端与基因组DNA相互作用。与每个DNA-pVII六聚体相关的pV可能有助于病毒基因组的凝聚。此外，pV与pIVa2（在DNA包装中的作用）的相互作用表明pV也可能在病毒DNA包装中发挥作用。同样，pV与核磷蛋白1/NPM 1/B23.1和pVII的相互作用导致了对其在病毒组装和病毒mRNA转录中作用的推测。此外，pV在感染细胞中与非结构蛋白33K和100K相互作用，表明其在病毒复制的其他阶段可能发挥作用。pV还与结构蛋白五边形基座和pIIIa相互作用，展现了pV病毒蛋白相互作用的复杂性。
2.3.蛋白IVa2 (pIVa2)
2.3.1.一般特性
腺病毒蛋白IVa2 (pIVa2)由腺病毒基因组的中间区域编码，通过选择性剪接从互补DNA链转录。IVa2 mRNA的表达似乎受到人类抗原R (HuR)蛋白[88]的上调。最初，pIVa2转录起始位点和细胞转录抑制因子(RF)结合位点重叠。由于pIVa2启动子序列与转录抑制因子(RF)的关联，与其他早期蛋白（除了pIX和E2蛋白）相比，pIVa2的表达被延迟。然而，一旦DNA复制，pIVa2启动子被激活，pIVa2转录开始。pIVa2在HAdV-5感染的细胞中表达为50 kDa和40 kDa的截断蛋白；然而，只有在BAdV-3感染的细胞中检测到50 kDa蛋白。pIVa2是核心蛋白之一，位于病毒衣壳内部，在组装中间体和成熟病毒粒子中以前体形式被检测到。一个成熟的腺病毒粒子似乎包含6-8份未加工的pIVa2。有效的腺病毒复制需要将病毒蛋白运输到不同的细胞器，包括细胞核和核仁。pIVa2利用importin α/β核输入途径的importin受体和pIVa2特异性NLS积极定位到细胞核。此外，pIVa2使用多个功能冗余的NoLSs[82,96]定位到核仁。有趣的是，由不同mAdVs编码的pIVa2的NLS和NoLS的位置似乎不共线。
2.3.2.功能
腺病毒pIVa2是一种多功能蛋白，通过与病毒DNA和不同的病毒/细胞蛋白相互作用，在病毒复制的不同步骤中发挥重要作用。首先，它作为转录激活因子，通过含有两个主要结合位点DE1和DE2a以及DE2b的下游结合元件(DE)激活主要晚期启动子(MLP)。蛋白pIVa2是DEF-A和DEF-B的组成部分，作为正向转录因子与MLP的DE元件相互作用。DEF-B（pIVa2的同二聚体）与DE2b位点相互作用，而DEF-A（pIVa2和p52/55K蛋白、pIVa2和22K或pIVa2和p33K的异二聚体）与DE1和DE2a位点相互作用。除了形成DEF-A复合体外，p52/55 kDa和pIVa2之间的相互作用似乎需要避免另一个转录因子DEF-B的过早形成。一旦pIVa2激活MLP，它就调节大多数晚期腺病毒结构蛋白的表达。有趣的是，含有pIVa2缺失或MLP的DE1和DE2位点突变的突变腺病毒并未显示晚期蛋白表达显著减少。此外，尽管MLP的DE元件与腺病毒DNA包装域的DNA结合基序相似，pIVa2的C-端DNA结合域的突变显著改变了腺病毒DNA包装，对晚期基因表达有中等影响。这些观察结果表明pIVa2在MLP的转录激活中可能不扮演关键角色。
其次，pIVa2在腺病毒DNA包装中发挥作用。pIVa2单独作为同二聚体或与病毒p22K形成复合体与腺病毒DNA包装域位于腺病毒DNA左端的CG核苷酸的A重复序列共识序列(5-TTTG-(N8)-CG-3)相互作用。特别是，p22K似乎通过促进两个pIVa2单体之间的相互作用帮助精确定位pIVa2到A重复序列。pIVa2与包装域的多个基序的结合可能将pIVa2在包装序列上排列为多聚体结构。
几项观察结果表明pIVa2似乎模仿ATPase，它水解DNA包装所需的ATP。首先，像ATPase一样，pIVa2也包含Walker A和Walker B基序，这是ATPase的一个特征。其次，pIVa2的二级结构分析预测与ATPase的附加链催化E (ASCE)类的相似性。第三，pIVa2结合并水解ATP。在不同腺病毒编码的pIV2中高度保守的Walker A和B基序的存在，以及含有pIVa2的Walker A基序中保守赖氨酸突变的病毒的非活性表明，Walker基序提供的功能对产生后代病毒粒子至关重要。Walker A和B基序参与ATP的结合和水解，从而为预先形成的空衣壳中DNA包装提供所需的能量。pIVa2的ATPase活性似乎受到蛋白p33K和腺病毒基因组的存在的刺激。含有pIVa2的Walker B基序突变的突变腺病毒组装成不含腺病毒DNA的空衣壳，表明pIVa2的ATP水解机制对将腺病毒DNA插入空衣壳至关重要。尽管早期报告建议pIVa2在衣壳组装中扮演重要角色，但在pIVa2缺失的腺病毒突变体中形成和检测到空衣壳表明pIVa2在腺病毒衣壳组装中不发挥作用。
2.3.蛋白IVa2 (pIVa2)
2.3.1.一般特性
腺病毒的IVa2蛋白由腺病毒基因组的中间区域编码，并通过选择性剪接从互补DNA链转录。IVa2 mRNA的表达似乎受到人类抗原R (HuR)蛋白的上调。起初，pIVa2转录起始位点和细胞转录抑制因子(RF)的结合位点是重叠的。由于pIVa2启动子序列与转录抑制因子(RF)的关联，与其他早期蛋白相比，pIVa2的表达会有所延迟，除了pIX和E2蛋白。然而，一旦DNA复制开始，pIVa2的启动子被激活，pIVa2的转录也随之开始。pIVa2在HAdV-5感染的细胞中表达为50 kDa的蛋白和40 kDa的截断蛋白；然而，只有在BAdV-3感染的细胞中检测到50 kDa的蛋白。pIVa2是核心蛋白之一，位于病毒衣壳内部，在组装中间体和成熟病毒粒子中都可检测到。成熟的腺病毒粒子似乎包含6-8份未加工的pIVa2。有效的腺病毒复制需要将病毒蛋白运输到不同的细胞区域，包括细胞核和核仁。pIVa2利用importin α/β核输入途径的importin受体和pIVa2特异性NLS，主动定位到细胞核。此外，pIVa2还利用多个功能冗余的NoLSs定位到核仁。有趣的是，由不同mAdVs编码的pIVa2的NLS和NoLS的位置似乎并不共线。
2.3.2.功能
腺病毒的pIVa2是一种多功能蛋白，通过与病毒DNA和不同的病毒/细胞蛋白相互作用，在病毒复制的不同阶段发挥重要作用。首先，它作为转录激活因子，通过下游结合元件(DE)激活主要晚期启动子(MLP)，该元件包含两个主要的结合位点DE1和DE2a以及DE2b。pIVa2蛋白是DEF-A和DEF-B的组成部分，作为正向转录因子与MLP的DE元件相互作用[98]。DEF-B（pIVa2的同二聚体）与DE2b位点相互作用，而DEF-A（pIVa2和p52/55K蛋白、pIVa2和22K或pIVa2和p33K的异二聚体）与DE1和DE2a位点相互作用。除了形成DEF-A复合体外，p52/55 kDa和pIVa2之间的相互作用似乎需要避免另一个转录因子DEF-B的过早形成。一旦pIVa2激活MLP，它就调节大多数晚期腺病毒结构蛋白的表达。有趣的是，含有pIVa2缺失或MLP的DE1和DE2位点突变的突变腺病毒并未显示晚期蛋白表达显著减少。此外，尽管MLP的DE元件与腺病毒DNA包装域的DNA结合基序相似，pIVa2的C-端DNA结合域的突变显著改变了腺病毒DNA包装，对晚期基因表达有中等影响。这些观察结果表明pIVa2在MLP的转录激活中可能不扮演关键角色。
其次，pIVa2在腺病毒DNA包装中发挥作用。pIVa2单独作为同二聚体或与病毒p22K形成复合体与腺病毒DNA包装域位于腺病毒DNA左端的CG核苷酸的A重复序列共识序列(5-TTTG-(N8)-CG-3)相互作用。特别是，p22K似乎通过促进两个pIVa2单体之间的相互作用帮助精确定位pIVa2到A重复序列。pIVa2与包装域的多个基序的结合可能将pIVa2在包装序列上排列为多聚体结构。
几项观察结果表明pIVa2似乎模仿ATPase，它水解DNA包装所需的ATP。首先，像ATPase一样，pIVa2也包含Walker A和Walker B基序，这是ATPase的一个特征。其次，pIVa2的二级结构分析预测与ATPase的附加链催化E (ASCE)类的相似性。第三，pIVa2结合并水解ATP。在不同腺病毒编码的pIV2中高度保守的Walker A和B基序的存在，以及含有pIVa2的Walker A基序中保守赖氨酸突变的病毒的非活性表明，Walker基序提供的功能对产生后代病毒粒子至关重要。Walker A和B基序参与ATP的结合和水解，从而为预先形成的空衣壳中DNA包装提供所需的能量。pIVa2的ATPase活性似乎受到蛋白p33K和腺病毒基因组的存在的刺激。含有pIVa2的Walker B基序突变的突变腺病毒组装成不含腺病毒DNA的空衣壳，表明pIVa2的ATP水解机制对将腺病毒DNA插入空衣壳至关重要。尽管早期报告建议pIVa2在衣壳组装中扮演重要角色，但在pIVa2缺失的腺病毒突变体中形成和检测到空衣壳表明pIVa2在腺病毒衣壳组装中不发挥作用。
2.4.腺病毒蛋白酶 (Adenain/AVP)
腺病毒蛋白酶 (AVP)，是一种在感染后期由腺病毒编码的保守内肽酶，是一种高度碱性蛋白，代表了一类新型的半胱氨酸蛋白酶。它特异性识别序列基序(M/I/L) XGX-G和(M/I/L) XGG-X（其中X可以是任何氨基酸）。有趣的是，AVP似乎发生了磷酸化。大约7-50份AVP被包装在成熟的病毒粒子中。新合成的AVP以非活性形式存在，在包装到未成熟的病毒粒子中并与病毒DNA结合后变得部分活性。与病毒DNA结合的AVP与滑动的pVI接触并在N-端和C-端切割它，释放出11个氨基酸的肽段（氨基酸240-250）辅因子pVIc。pVIc与结合到病毒DNA上的AVP的结合激活了蛋白酶。最后，腺病毒前体蛋白通过AVP-pVIc复合体沿着病毒DNA在病毒粒子中的滑动被定位。最近的一项研究表明，11个氨基酸的pVIc作为分子雪橇，使AVP沿着DNA滑动。AVP对病毒成熟和产生传染性后代病毒粒子以及在细胞质中适当解聚/释放进入的病毒粒子至关重要。AVP在病毒粒子中切割腺病毒前体蛋白(IIIa、VI、VII、VIII、Mu/X和TP)。此外，非结构蛋白52K/55K，需要用于基因组包装，也在DNA存在的情况下被AVP切割，识别共识和非共识蛋白酶切割位点。有趣的是，AVP在没有两个病毒辅因子的情况下也能切割蛋白，即病毒DNA和pVIc。由BAdV-3、HAdV-5或猪腺病毒-3 (PAdV-3)编码的AVP在转染细胞的细胞质中切割BAdV-3 100K，识别非共识（"FRASAF"和"IRAAGR"）病毒蛋白酶切割位点，这对BAdV-3的复制不是必需的。类似地，在腺病毒感染后期，腺病毒蛋白酶在肌动蛋白存在的情况下在细胞质中切割细胞角蛋白18。AVP的独特生物学特性和活性和非活性形式的AVP晶体结构的可用性，促进了抗腺病毒药物的开发和评估。
2.5.蛋白X (Mu)
蛋白Mu (pMu)，由腺病毒晚期转录本编码，由于精氨酸残基含量高，是一种高度碱性蛋白。pMu包含不重叠的核定位信号和核仁定位信号。此外，pMu包含两个功能性的AVP共识切割位点序列，这些序列被AVP识别以产生三个片段；(a) 疏水性的N-端氨基酸1-31，(b) 碱性的中间部分氨基酸32到50，以及(c) C-端氨基酸51-79。在成熟的病毒粒子中大约有100-300份缺少19个氨基酸的中间部分（氨基酸32到50）。
前体pMu非共价地结合病毒DNA，并与其他病毒核心蛋白一起在凝聚病毒基因组中发挥作用。前体pMu的C-端有一个高度保守的区域，涉及改变E2蛋白的积累。有趣的是，将成熟的Mu肽添加到脂质体转染试剂中可以将转染效率提高11%。交联研究揭示了病毒核心中多肽V和Mu以及VII-V-Mu蛋白之间的相互作用。
2.6.末端蛋白
由腺病毒基因组E2B区域编码的末端蛋白是一种非基本核心蛋白，它共价结合到病毒双链DNA的每个5'末端。因此，病毒粒子中只有两份末端蛋白。此外，前体末端蛋白包含两个潜在的腺病毒蛋白酶切割位点。末端蛋白作为DNA复制的引物，是病毒DNA复制的必需蛋白之一。实际上，末端蛋白需要有效地启动DNA复制并防止错误的内部启动。此外，末端蛋白似乎保护腺病毒DNA不受核酸酶活性的影响。
3. 总结
总之，在过去十年中，已经阐明了腺病毒核心蛋白在病毒感染的不同阶段的结构和功能，包括逃避先天免疫反应的诱导和病毒-细胞相互作用的初始阶段（表1）。这可能是由于探索AdV结构的更先进技术的可用性以及对开发更有效腺病毒载体的兴趣。旨在确定核心蛋白相互作用的生物学功能的未来发展研究应该有助于探索并提供更深入的关于腺病毒生物学中核心蛋白的知识。
表1.犸斯塔腺病毒核心蛋白功能总结
