双载荷ADC、双特异性ADC是近些年来ADC研发的热点方向。上上期为大家分享了双载荷ADC的知识，今天为大家解读一篇关于双特异性ADC的文章，一起学习起来。
首先我们先再看下目前ADC的获批情况（表1）。
c: hbelantamab mafodotin于2020年获得FDA的加速批准，但由于III期试验失败，退出程序于2022年启动。
1.双特异性ADC
双特异性抗体是新一代抗体分子，旨在识别两种不同的抗原结合位点，目前已有14种双特异性抗体获得市场批准，100多种双特异性抗体处于临床试验阶段（见表2）。它们有多种应用，包括效应细胞桥接、受体交联、辅因子模拟和提高药物传递效率等。
双特异性抗体技术的出现为ADC的形式提供了更可能，双特异性抗体可用于提高肿瘤特异性和促进抗原内化。有效载荷与双特异性抗体结合产生双特异性ADC是一种新兴的癌症治疗策略。自2019年以来，越来越多的双特异性ADC进入临床试验（图1）。
图1 双特异性ADC的发展史
双特异性ADC具有类似于单特异性ADC的结构。具有双重特异性的抗体通过可切割或不可切割的连接体附着在不同的分子靶标上，并与细胞毒性药物相连。双特异性ADC和单克隆ADC之间的差异总结于表3。
表3 单克隆ADC与双特异性ADC的差异
双特异性ADC和传统单克隆ADC在几个方面有所不同。从机制上讲，双特异性ADC可以结合多种抗原或不同的表位，通过同时干扰多种信号通路来对抗耐药性 ，双特异性ADC 可以用选择性组合的靶点构建，实现协同作用。有效抑制肿瘤细胞活性，促进受体内化和溶酶体运输（图2）。
(A)双特异性ADC包括三个关键要素：与肿瘤细胞表面表达的多种抗原或不同表位结合的双特异性抗体片段；诱导肿瘤细胞凋亡的细胞毒性药物；连接子，确保有效载荷在肿瘤细胞内释放，而不是过早地释放到血液中。
(B)双特异性ADC通过同时阻断多种信号通路来对抗耐药性。
(C)双重靶向策略增加了肿瘤细胞的选择性，减少了健康组织中的脱靶毒性。
(D)双异位ADC促进受体交联和聚集。
ADC，通过增强受体交联和聚集增加内化(图2D)。
针对肿瘤抗原和快速内化受体的双特异性抗体可增加ADC的内化和细胞毒性，Lee等研究了细胞表面抗原密度比与双特异性ADC内化的关系，他们构建了针对内化抗原EphA2和非内化抗原ALCAM的双特异性抗体；当细胞表面EphA2与ALCAM的比例超过1:5时，内化抗原EphA2促进双特异性抗体对ALCAM的清除；将非内化抗原转化为内化抗原。类似的策略应用于抗CD63/HER2双特异性抗体。CD63是一种溶酶体相关膜糖蛋白主要存在于溶酶体和核内体中，调节其他蛋白质的转运，抗CD63抗体促进内化和溶酶体运输，而HER2结合臂特异性识别HER2阳性肿瘤细胞。双特异性抗CD63 /HER2 ADC偶联微管蛋白受体杀死HER2阳性肿瘤细胞比单抗HER2和抗CD63 ADC更有效。
此外，双表位抗体可以提高ADC在低抗原表达水平患者中的疗效，抗HER2双异位抗体已被用于ADC的临床试验。此外，针对FRα的双异位ADC已被研制出来，以提高低FRα表达水平患者的疗效。此外，靶向受体的双异位抗体，如cMet，通过促进受体表达的下调和破坏循环，从而改善激酶抑制剂（KIs），实现比单特异性抗体更高的生长抑制率。抗cMET双异位ADC的作用机制涉及靶向肿瘤抗原，将药物递送到肿瘤细胞。这种靶向模式对低抗原表达水平的患者可能效果有限。Fan等，构建了由两个串联融合的抗EGFR纳米颗粒组成的四价双异位抗EGFR ADC，靶向两个不同的非重叠表位。他们将Fc结构域融合到ADC中，并引入E430G突变，以增加ADC药物的CDC作用。
由于小片段ADC分子量低，在穿透实体肿瘤方面比其他类型的ADC具有优势，然而，低分子量导致ADC半衰期短和快速清除。非特异性抗体策略可以弥补小片段抗体半衰期短的缺陷。基于白蛋白的给药策略可以改善抗体片段的生物分布，促进肿瘤沉积。AB.Fab4D5是一种靶向HER2和白蛋白的双功能分子，可以快速从血液中清除，抑制正常组织的暴露，并且可以比曲妥珠单抗衍生的Fab（Fab4D5）和曲妥珠单抗更有效地在肿瘤部位积累，与传统抗体曲妥珠单抗类似，AB.Fab4D5表现出肿瘤沉积和滞留。同样的策略用来构建双特异性ADC，针对5T4和白蛋白的结合域(ABD) -双特异靶向5T4和白蛋白与细胞毒性吡咯苯二氮卓（PBD）结合，以改善药代动力学。在体内，这种双特异药物偶联物具有较长的半衰期，良好的肿瘤生长抑制作用，以及比聚乙二醇抗体片段偶联物更高的耐受性。
1.3 临床试验中的双特异性ADC
ADC药物BL-B01D1是一种靶向EGFR和HER3的四价双特异性抗体，通过可切割连接体与拓扑异构酶I抑制剂偶联。与其他EGFR家族成员不同，HER3依赖于与其他受体的异源二聚化，特别是EGFR和HER2，用于下游信号激活。这种异源二聚化使HER3能够促进细胞增殖、肿瘤形成、转移和耐药性。BL-B01D1的作用机制涉及两个过程。它通过内吞作用进入细胞，释放DNA损伤剂，杀伤肿瘤细胞，此外，它阻断EGFR和HER3异源二聚体的形成，抑制下游细胞生长信号。在一项针对122名局部晚期或转移性实体瘤患者的I期临床试验中，34例患者接受了第三代EGFR酪氨酸KI （TKI）治疗或铂类化疗。客观缓解率（ORR）为61.8%，疾病控制率（DCR）为91.2%，表明其对于EGFR TKI耐药NSCLC患者有治疗的潜力。
cMet以依赖或不依赖HGF的方式二聚并激活下游信号通路，在某些情况下，突变(例如METex14)或MET基因扩增认为是对EGFR或cMet TKIs获得性耐药的关键因素，实现对目前TKI疗法的持久反应仍然具有挑战性。REGN5093-M114是一种双异位ADC，靶向cMet的多个表位。抗cMet/cMet抗体识别cMet独特的非重叠表位，比亲本抗体更有效地促进内化和降解。蛋白酶清除连接体，类麦黄素有效载荷（M24）和抗cMet/cMet抗体。一旦ADC的抗体部分靶向并进入肿瘤细胞，连接体在次级和循环核内体中被切割，释放有效载荷以有效消除肿瘤细胞。在met扩增/ met突变的Hs746T异种移植模型中，未偶联的抗cMet/cMet双特异性抗体最初导致肿瘤完全消退，肿瘤随后会再次出现。然而，REGN5093-M114完全抑制和清除逃逸肿瘤。在met扩增的非小细胞肺癌患者来源的异种移植（PDX）模型中，哪一种对cMet抑制剂有耐药性，非偶联抗cMet/cMet双特异性抗体仅延缓肿瘤生长，而ADC则诱导肿瘤完全和持续消退。此外，REGN5093-M114在食蟹猴中显示出良好的毒性。
ZW49和MEDI4276是设计不同的抗HER2双表位ADC。抗体成分MEDI4276采用四价对称设计，同时识别HER2的胞外结构域2 (ECD2)和胞外结构域4 (ECD4)，触发受体交联，促进内化。在体内，MEDI4276在HER2低表达的肿瘤模型中显示出良好的疗效，并在食蟹猴中显示出可接受的安全性。ZW25是的抗体成分，ZW49由一个抗HER2 - ECD4单链可变片段（scFv）和一个抗HER2 - ECD2片段抗原结合域（Fab）组成。这种非对称二价格式ADC是由Zymeworks使用专有的Azymetric和ZymeLink平台。ZW49的内化和溶酶体转运优于抗HER2单特异性ADC。在另一种抗HER2双异位ADC MEDI4276的I期剂量递增研究中，当剂量超过0.9 mg/kg，2例肝功能试验出现3级剂量限制性毒性，限制了治疗窗口期，此外，47例HER2阳性乳腺癌和胃癌患者正在接受治疗，最常见的3/4级药物相关不良事件是AST升高（21.3%），5例患者因药物相关不良事件停止治疗。因此，推测临床试验中较低的胃肠道毒性和肝毒性可能与ADC的“靶上”效应，MEDI4276相关的肝毒性是否依赖于HER仍不清楚。相比之下，ZW49的安全性较高，大多数患者的严重程度仅为1级或2级。然而，在ZW49治疗剂量为2.5mg/kg Q3W的患者中，客观缓解率为28%，DCR为72%，这表明ZW49的效果不如预期的明显。这些不同的临床结果可能源于抗体片段、DAR和有效载荷的差异，MEDI4276和ZW49靶向HER2的ECD4和ECD2表位。为了降低ADC的靶毒性风险，在临床前阶段考虑靶抗原、器官或细胞类型、健康细胞的再生潜力以及有效载荷的作用机制之间的表达谱差异至关重要。
其他抗HER2双表位ADC，如JSKN003和TQB2102也在进行临床试验，JSKN003是一种含有KN026的ADC，KN026是一种双特异性抗体，靶向HER2的细胞外结构域II和IV，并通过特殊的连接物偶联到拓扑异构酶I抑制剂上。该ADC具有HER2高亲和力结合，高效内化在HER2阳性癌细胞和肿瘤生长抑制的临床前模型。食蟹猴的药代动力学分析显示，最高非严重毒性剂量为30 mg/kg。TQB2102采用类似的scFv-Fab配置ZW49，降低了双特异性抗体生产过程中轻链错配的风险。值得注意的是，利用氘化Dxd作为有效载荷，ADC的抗肿瘤效果优于单独的DxdNCI-N87细胞。当对基于曲妥珠单抗的ADC进行评估时，这种双特异性ADCC在her2阳性NCI-N87和SK-BR-3肿瘤细胞显示出更高的内吞效率。
MUC1和EGFR之间的相互作用与EGFR和EGFR介导的信号传导的激活有关，靶向MUC1- c可以帮助克服对EGFR TKIs的耐药性。M1231是一种二价非对称双特异性抗MUC1/EGFR ADC，能向表达MUC1和EGFR的肿瘤细胞递送微管抑制剂。双重靶向可以提高ADC的疗效，降低脱靶毒性。这种药物是基于链交换工程结构域和Xpress CF+平台用于制备双特异性抗体和掺入非天然氨基酸。在PDX模型中，抗MUC1 /EGFR双特异性抗体比单特异性双价抗体表现出更高的内化、溶酶体运输和抗肿瘤活性。在体内，单次注射M1231可使NSCLC和ESCC PDX模型的肿瘤完全消退。另一种新型双特异性抗MUC1/EGFR ADC，BSA01，在临床前评估中显示出强大的抗肿瘤活性，减少了EGFR臂的结合和内化，从而降低了非特异性靶向引起的皮肤毒性。
EGFR和cMet是肿瘤免疫治疗中的两个关键靶点，它们在信号通路之间表现出协调，可导致肿瘤对EGFR和cMet TKIs产生耐药性。AZD9592是一种双靶向ADC，可选择性结合肿瘤细胞表面受体EGFR和cMet，并向肿瘤细胞递送拓扑异构酶I抑制剂。这种设计增加了治疗窗口，克服了肿瘤细胞的耐药性。AZD9592抗体设计为旋钮入孔双特异性抗体结构，并使用低亲和力抗原结合结构域将EGFR相关的皮肤毒性降至最低。临床前实验显示AZD9592主要诱导DNA双链断裂通过传递和释放拓扑异构酶I，导致肿瘤细胞死亡。在EGFR突变的PDX模型中，单剂量8mg/kg AZD9592抑制了73%（16/22）患者的肿瘤生长。
FRα是细胞膜上的叶酸结合蛋白，与肿瘤进展有关，它在多种实体肿瘤中过表达，如三阴性乳腺癌、肺癌，尤其是卵巢癌，证明了它作为治疗靶点的潜力。IMGN853（表1中的mirvetuximab soravtansine）是一种靶向FRα的ADC，包含抗FRα单克隆抗体M9346A，通过可切割的连接物与微管蛋白抑制剂DM4偶联。高ERα铂耐药上皮性卵巢癌的II期SORAYA研究中，IMGN853表现出有效的抗肿瘤活性，ORR为32.4%，5例患者获得完全缓解，29例患者部分缓解。然而，在III期临床试验中，IMGN853对低FRα表达的患者几乎没有益处，促使IMGN151的发展（双表位ADC）。IMGN151双特异抗体部分采用非对称形式，靶向不同FRα抗原表位。此外，连接-药物复合物包括新型有效的美坦辛衍生的DM21-LG。在体外，IMGN151对中、低FRα表达的肿瘤细胞具有比IMGN853更强的杀伤活性。IMGN151在具有不同FRα表达水平的人类肿瘤异种移植模型中实现了完全的肿瘤消退。临床应用的双特异性ADC药物的靶点很少，主要是表皮生长因子受体家族（EGFR、HER2和HER3）、cMet和MUC1。设计双特异性ADC的主要目的是提高低抗原表达患者的治疗效果，降低脱靶正常组织毒性，克服耐药。
ADC的发展应考虑五个关键方面：靶抗原选择、连接体、有效载荷、偶联策略和抗体片段。开发双特异性ADC的另一个挑战是在生产IgG双特异性抗体过程中重链和轻链的错配。目前，有许多技术可以用来解决这个问题。此外，小片段抗体的应用促进了双特异性ADC的构建。因此，研究人员可以将重点放在有效载荷、连接体、共轭技术、抗体亲和力的优化上。
为了减轻脱靶毒性，靶抗原应该是非分泌性的，肿瘤特异性的，并且在肿瘤细胞上唯一表达，将肿瘤细胞与正常组织区分开来。此外，一个有效的ADC需要一个有利于内化和具有低内吞循环率的靶标。
肿瘤抗原的特异性和表达强度显著影响ADC的靶点选择。这些肿瘤抗原可分为肿瘤相关抗原（TAAs）和肿瘤特异性抗原(TSAs)。癌胚或白细胞分化等抗原属于TAA类别，与正常细胞相比，在肿瘤细胞中过度表达或失调。然而，TAAs特异性不足会导致脱靶效应。考虑到上述因素，双靶向ADC的两个TAA在肿瘤中必须呈现类似的表达特异性模式。同时，TAA在正常组织中的表达应该很少，没有重叠。
新抗原是肿瘤通过基因突变或其他机制产生的肿瘤特异性突变肽，是肿瘤免疫治疗的理想靶点。新抗原以肽/MHC复合物的形式出现在肿瘤细胞表面，可被抗体识别。例如，针对TP53中最常见的突变R175H的双特异性单链糖尿病可以有效地激活T细胞，即使在癌细胞表面的肽-HLA复合物密度极低的情况下，突变仍然可以被靶向。激活的T细胞可以在体外和小鼠体内裂解含有新抗原的癌细胞。新抗原可以明确区分肿瘤细胞和正常细胞，增加ADC的选择性。KRAS G12V肽可以与MHC I分子结合，导致其在肿瘤细胞表面呈现。这种多肽- MHC I复合体，被认为是一种TSA，可以被TCR模拟抗体识别。研究人员将TCR模拟抗体与微管蛋白抑制剂MMAE偶联在一起，设计了一种新型的TCR模拟抗体靶向KRAS G12V肽- HLA复合物的TCR - ADC；获得的ADC在异种移植物模型中显示出明显的抗肿瘤活性。以20 mg/kg每4天4次（q4d × 4）的剂量给药后，观察到治疗小鼠的体重和器官组织形态学均未发生显著变化，支持TSA靶向方法的安全性和耐受性。非化ADC的设计可以拓宽双特异性ADC的目标范围。活化的血小板和肿瘤基质的一些特异性蛋白，如MMP9和Gal3BP，可以作为ADC的非内化靶点。一种专门针对肿瘤新生血管的血管靶向ADC消除了内化的需要，依赖于细胞毒性药物递送过程中肿瘤细胞死亡导致的谷胱甘肽和半胱氨酸的释放。将该靶点与TSA结合构建的双特异性ADC可能通过多种机制抑制肿瘤。
另一种扩大靶点选择范围的方法是构建抗体药物偶联物。掩蔽肽通过可切割间隔连接到抗体轻链的N端，肿瘤微环境中的反应去除掩蔽肽，使抗体与肿瘤细胞表面的靶标结合，而不与正常组织结合。CX2029是一种抗CD71抗体药物偶联物，偶联微管蛋白抑制剂MMAE，DAR为2。与前体策略一样，抗体的pH依赖性或ATP依赖性条件激活可以增加选择性，并可能有助于ADC的设计。
肽连接物广泛应用于第三代ADC的开发。这些连接体通过溶酶体酶进行蛋白水解裂解，比化学反应性连接体更有效地提高了血浆中的稳定性。双特异性ADC通常使用蛋白酶可切割肽连接体，并且在连接体技术上与单特异性ADC没有显著差异。由于疏水性增加，DAR值升高的ADC表现出加速的血浆清除，这可能会损害其体内疗效。此外，疏水性的增强破坏了具有高DAR的ADC的稳定性，使其易于聚集。因此，ADC通常维持DAR平均值范围从2到4，在稳定性和有效性之间进行了优化权衡。
针对亲水性进行优化的新型连接物可以减轻高DAR ADC低亲水性引起的血浆清除和聚集，从而增加ADC的暴露和体内功效。该技术已应用于双特异性ADC。TQB2102采用了一种亲水性接环，类似于GGFG接环DS8201，促进抗体更大的有效载荷。
鉴于给药ADC到达肿瘤部位的比例很低，选择一种有效且稳定且毒副作用最小的细胞毒性药物载荷是设计双特异性ADC的必要条件。临床试验中的双特异性ADC主要包含两类有效载荷：微管和DNA抑制剂。拓扑异构酶I抑制剂的一个主要例子是Dxd。该exatecan衍生物已在DS-8201a（表中的trastuzumab deruxtecan，表1）中应用， DAR值为8，因其有效性高，已获得FDA批准。拓扑异构酶I抑制剂可作为微管抑制剂和DNA损伤剂的替代治疗选择。几种双特异性ADC，如JSKN003和TQB2102是在Dxd基础上进一步改造而成的。在一些ADC设计中，聚乙二醇与MMAE连接，在与抗体位点特异性偶联后，延长了小片段双特异性抗体的半衰期并降低了免疫原性。
ADC的另一个关键特性是均一性，这主要是由共轭方法决定的。赖氨酸随机偶联可以产生具有广泛DAR分布的ADC。另外，考虑到IgG1含有4个链间二硫桥，基于半胱氨酸的偶联可以产生具有2个、4个、6个或8个均匀DAR的ADC。然而，在这些随机偶联方法产生的ADC中，有效载荷可能不会连接到相同的抗体位点，这可能会降低ADC的稳定性和均匀性。定点偶联技术可以增加ADC的均匀性。
2.5 抗体片段
双特异性ADC价态的选择需要仔细考虑预期的目标和目的。增加抗体的效价可以加强受体交叉反应，提高结合稳定性，优化药物递送效率。相反，当目的是增加靶标选择性时，特别是对于在正常组织中低表达的抗原，则应降低双特异性ADC中相应结合臂的价态。Andreev等构建了抗HER2/PRLR双特异性ADC。与HER2相比，PRLR可以有效地内化并转运到溶酶体中。在体内，DAR为4的二价抗HER2 ADC比DAR为4的抗APLP2/HER2 ADC更有效DAR。HER2二聚体之间的相互作用是影响HER2 ADC疗效的重要因素，抗APLP2/HER2 ADC由于不能介导HER2二聚体的作用，其疗效有限。因此，抗HER2/HER2/APLP2双特异性ADC的研究可能是未来ADC设计的一个方向。根据双靶向原理，研制出了比双特异性抗体更有效的多价四特异性抗体。然而，增加双特异性抗体的效价可能会降低靶标的选择性，尽管表现出对EGFR的亲和力降低，四价抗-HER2/EGFR双特异性抗体（2 + 2）不能区分模拟的正常组织和目标肿瘤，与它的二价对应物不同（抗HER2/EGFR双特异性抗体（1 + 1））。
在双特异性ADC的发展过程中，ADC的肿瘤穿透能力被设计为改善内化，包括双异位或双靶向ADC，可能受到实体肿瘤中固有的结合位点屏障的限制。需要大量的实验来优化双特异性抗体的亲和力和内化能力，并确保ADC肿瘤吸收和双特异性渗透之间的平衡。一种可行的替代方案是在设计小片段双特异性ADC时降低抗体的分子量。由于其分子量小，小片段的靶向治疗提供了增加渗透到实体瘤，能否克服实体瘤的生物屏障。此外，与具备Fc片段的传统单克隆抗体相比，小片段与Fc受体的交叉反应性降低，免疫原性降低，与正常组织的相互作用减弱。这些特性促进了它们在肿瘤部位的优先积累，为将细胞毒性药物有效地递送到实体肿瘤提供了一条有希望的途径。Wu等报道了一种针对肿瘤抗原5T4的全人源单域抗体（UdAb）。他们通过与DNA转录抑制剂SN38的位点特异性偶联产生了一种小片段ADC n501-SN38，DAR为1。与传统ADC m603-SN38相比，n501-SN38具有优异的肿瘤穿透性。在1 h时，n501-SN38在肿瘤部位达到峰值积累，摄取率是m603-SN38的11倍。除了UdAb，研究人员已经构建了双特异性纳米体药物偶联物（NDCs），结合双异位纳米体对抗EGFR，钆结合域和一个C3标签。双特异性NDC有助于精确靶向EGFR阳性癌细胞。与纳米体结合后，顺铂在EGFR阳性肿瘤内蓄积，其在肾和肝系统内的分布受到明显限制。抗白蛋白纳米体的掺入大大提高了这种NDC的特异性和治疗效果。
链霉亲和素具有独特的结合特性和强大的稳定性，可以作为支架将ADC组装成三种类型的成分：链球菌标记的抗体片段、多价蛋白适配器和链球菌标记的连接剂药物。这种模块化设计使不同抗体和连接药物的组装成为可能。在类似的方法中，人类非胶原三聚结构域，形成具有癌胚抗原靶向能力的强大三聚体免疫毒素，为抗体提供了多种有效载荷递送选择。连接体可以作为构建双特异性ADC的支架。一类双功能支链连接体可以与有效载荷和肿瘤靶向配体进行点击化学反应，并偶联到单克隆抗体上。这个过程产生双靶向ADC，可能对异质抗原表达的肿瘤有效。
在多价ADC的设计中使用寡聚支架具有以下优点：支架允许多个识别不同表位或抗原的抗体片段的组装；多价抗体可以更紧密地与受体结合，使药物精准靶向，减少脱靶毒性；诱导受体在肿瘤细胞表面聚集，形成免疫复合物，促进ADC内化进入肿瘤细胞并转运至溶酶体。此外，多种药物可以附着在支架上，以克服肿瘤细胞的耐药性。不同的支架，包括IgG的Fc片段，可能产生各种新的双特异性ADC，并进一步提高这些治疗方法的靶向选择性和有效性。
