神经变性疾病与睡眠障碍之间存在密切关联。在肌萎缩性侧索硬化-额颞叶痴呆（ALS-FTD）谱系疾病患者中，观察到睡眠节律紊乱，然其具体机制尚不明确。TAR DNA结合蛋白43 (TDP-43)在ALS的病理过程中发生定位改变，并在细胞质异常聚集，这是ALS的主要病理特征，同时也与其他神经变性疾病（如FTD、阿尔兹海默症、原发性侧索硬化和进行性肌萎缩等）相关联。果蝇因其具有与人类类似的昼夜节律调控机制，以及其基因可操作性强、生长繁殖快且行为易于观察等优势，成为探索睡眠与神经变性疾病关系的理想模型。
为分析ALS患者睡眠节律紊乱的分子机制，近期发表在Science Advances杂志的一项研究使用果蝇模型来评估TDP-43对睡眠节律的影响，为神经退行性疾病的睡眠障碍提供了新见解。
这项研究使用了多种果蝇菌株，包括Iso31（常用野生型）、Daughterless-GS（用于特定基因表达）、UAS:Aβ Arctic flies（用于神经变性研究）、和Elav-Gal4 (#458, 神经元特异性表达）。实验中应用RU486和雷帕霉素进行药物处理，RU486用于激活UAS驱动的基因表达，雷帕霉素用于调查代谢和睡眠影响。通过CO2麻醉和DAM系统进行睡眠分析，使用TrimGalore和STAR软件对RNA测序数据进行分析，并使用DESeq2分析差异表达，通过GO和KEGG通路分析探索差异基因涉及的功能和生物过程。进一步使用RNAi筛选出影响TDP-43睡眠表型的候选基因。酶联免疫吸附法测定葡萄糖/糖原水平，使用Glycogen-Glo Assay kit并记录光度。使用免疫印迹分析检测蛋白质表达。统计分析使用GraphPad Prism进行，包括t检验、方差分析和多重比较测试，确保数据的可靠性和显著性。每个实验至少进行三次独立的生物学重复，以保证结果的可复制性和统计显著性。这些方法整合了基因表达调控、生物行为分析和分子生物学技术，为研究睡眠调控及神经变性疾病机制提供了全面的实验支持和数据基础。
1. 人类TDP-43在果蝇中表达导致睡眠紊乱。
表达人类TDP-43蛋白的果蝇，夜间睡眠时间显著减少约200分钟（图1A），白天睡眠时间亦出现明显缩短，且伴有睡眠碎片化表现（图1B-H）。值得注意的是，没有检测到TDP-43果蝇的运动变化，提示TDP-43表达相关的睡眠紊乱与TDP-43的运动神经元毒性无关，是独立的睡眠调节机制。进一步分析显示，TDP-43和对照果蝇在夜间对机械睡眠剥夺的反应相似，并且在睡眠剥夺后表现出正常的补偿性睡眠增加（图2A和2B），表明TDP-43果蝇的睡眠稳态功能完好，这些结果表明TDP-43会破坏睡眠持续时间和连续性，但不会导致广泛的昼夜节律障碍。
图1. 人类TDP-43在果蝇中表达导致睡眠紊乱。(A) 神经退行性疾病基因表达模型中睡眠表型的筛选；(B) TDP-43果蝇在乙醇（黑色轨迹）或RU486（绿色轨迹）食品上7天后的睡眠轨迹；(C至E) TDP-43果蝇的白天睡眠时长（C）、睡眠节数（D）和睡眠节长度（E）的量化（每种条件超过32只果蝇）；(F至H) TDP-43果蝇的夜间睡眠时长（F）、睡眠节数（G）和睡眠节长度（H）的量化（每种条件超过32只果蝇）。
图2. 表达人类TDP-43的果蝇在睡眠剥夺后保持睡眠稳态。（A）TDP-43和对照果蝇在睡眠剥夺前、剥夺期间、以及剥夺后12小时的睡眠轨迹；（B）从基础记录到恢复睡眠记录中总睡眠时间的量化分析。
2.TDP-43对果蝇睡眠表型影响具有剂量依赖性。
研究者通过调节RU486浓度来改变TDP-43表达水平，发现TDP-43蛋白水平与RU486浓度呈剂量依赖关系（图3A和B）。在相同的RU486浓度下，果蝇的睡眠损失时间随RU486浓度增加而增加（图3D和G），表明蛋白量与睡眠时长之间存在直接相关性（图3C、D和G）。即使在较低的RU486浓度下，TDP-43也导致显著的睡眠长度缩短和片段数增加，显示出睡眠连续性对TDP-43水平更为敏感（图3F）。
图3.TDP-43对睡眠表型的影响呈剂量依赖性。
3.敲低Atx2可以挽救TDP-43相关的睡眠紊乱。
通过在果蝇中使用RNAi敲低Atx2，可以显著恢复TDP-43表达相关的睡眠缺陷（图4A-G），表明Atx2在调节TDP-43相关睡眠异常中具有关键作用。
图4. Atx2敲低可以挽救TDP-43诱导的睡眠紊乱。
4. 小分子代谢途径介导敲低Atx2对TDP-43睡眠紊乱的挽救。
结合RNA测序分析，发现TDP-43果蝇脑中有3295个转录本差异表达，其中1657个上调，主要涉及小分子代谢处理和MAPK信号通路（图5D和E）。Atx2 RNAi敲低显著延长了TDP-43果蝇的寿命，并且在TDP-43表达的果蝇脑中，有396个上调的转录本在共表达Atx2 RNAi后下调（图5F）。这些下调的转录本主要富集在小分子代谢处理和分解代谢处理途径中，表明Atx2 RNAi可以通过调节代谢处理途径减少TDP-43毒性（图5G）。
图5. 敲低或不敲低Atx2的TDP-43果蝇脑组织的RNA测序分析。
本研究利用果蝇模型确定了TDP-43在调节睡眠节律中的作用。TDP-43表达可以诱导果蝇睡眠紊乱，而通过敲低Atx2可以拯救这种睡眠障碍。该研究结果揭示了TDP-43毒性与睡眠障碍之间的联系，并强调Atx2在挽救TDP-43毒性过程中代谢途径的贡献。
Perlegos AE, Durkin J, Belfer SJ, et al. TDP-43 impairs sleep in Drosophila through Ataxin-2-dependent metabolic disturbance. Sci Adv. 2024 Jan 12;10(2):eadj4457. doi: 10.1126/sciadv.adj4457. PMID: 38198547.
校 审：商慧芳
