聚（ADP-核糖）（PAR）促进C9ORF72基因表达的富精氨酸二肽重复蛋白的毒性
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2024-11-28 17:00
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C9ORF72基因上的GGGGCC(G4C2)六核苷酸重复扩增是肌萎缩侧索硬化（ALS）/额颞叶痴呆（FTD）的主要遗传原因，ALS/FTD的独特病理特征是包含重复序列转录本的病灶以及异常翻译的二肽重复蛋白的聚集。五种不同的二肽重复蛋白中富精氨酸二肽重复蛋白(R-DPR) poly(GR) 和poly(PR)毒性最高，但是R-DPR的聚集是如何调控的仍然不清楚。应激颗粒（SGs）是细胞应激时组装的RNA/蛋白凝聚物，正常情况下SGs在应激条件消失时可以动态解聚，动态异常的SG与SG蛋白（比如TDP-43，FUS，hnRNPs等）聚集密切相关，有研究报道R-DPR与许多SG蛋白相互作用，会导致细胞在无应激条件下也能形成异常动态SGs。之前的研究发现通过基因或药理学手段抑制SG组装可以抑制R-DPR诱导的细胞毒性或神经退行性变。这些研究表明，R-DPR可能促进异常SG形成和蛋白质聚集，从而推动神经退行性变。然而，这些过程的调控机制仍不明确。聚（ADP-核糖）（poly（ADP-ribose）, PAR）是一种高度动态的聚合物，可通过多聚ADP-核糖基化修饰(PARylation，PAR化)在翻译后修饰蛋白质。PAR受到PAR聚合酶（PARP）和PAR糖水解酶（PARG）的严格调控（分别负责合成和降解），PAR在细胞生理中具有重要作用，包括在应激颗粒（SGs）组装中的关键作用，许多SG蛋白会发生PAR化或与PAR结合，然而，升高的PAR水平可能具有毒性，例如，PARP1的过度活化可诱导一种特殊的程序性细胞死亡——PARthanatos，而PARG的缺失分别导致果蝇神经退行性变或小鼠胚胎致死。在c9ALS/FTD患者神经元中已报道存在升高的核PAR水平，但PAR是否以及如何与c9ALS/FTD的发病机制相关仍不清楚。![]()
一、Parp/PARP1功能的缺失抑制了c9ALS/FTD模型中的神经退行性变通过前期的RNAi文库筛选，研究团队鉴定出102个基因通过RNA干扰（RNAi）能够强烈或中度抑制果蝇c9ALS/FTD模型中的眼变性。与其他研究的结果合并分析后发现parp（人类PARP1的果蝇同源基因）是在多个筛选中均被鉴定出的四个基因之一。为验证parp RNAi是否能够抑制c9ALS/FTD果蝇模型中的神经退行性变，研究者测试了两个独立的parp RNAi品系，结果显示它们均能抑制 (G4C2)30模型中的眼变性（图1A）。此外，过表达PARG（可降低PAR水平）也能抑制(G4C2)30果蝇的眼变性（图1A）。研究者接下来验证parp RNAi是否在其他c9ALS/FTD果蝇模型中也能抑制眼变性。parp RNAi能够抑制表达36个GR或PR重复序列[(GR)36或(PR)36]的果蝇的眼变性（图1B）。此外，PARG的过表达（图1B）或使用PARP1/2抑制剂PJ34，也能抑制果蝇的眼变性（图1C）。综合来看数据表明降低PAR水平能够抑制多个c9ALS/FTD果蝇的眼变性。此外研究者也发现了降低PAR能抑制c9ALS/FTD果蝇模型中的运动缺陷（图1D）。图1 Parp/PARP1 功能的缺失抑制了 c9ALS/FTD 果蝇模型中的神经退行性变。为验证上述发现，研究者使用了四个c9ALS/FTD诱导多能干细胞来源的神经元（iPSN）系，以及三个年龄和性别匹配的对照系及同源基因对照系。在ALS/FTD（包括c9ALS/FTD）中常见的神经缺陷是对谷氨酸诱导兴奋性毒性的高度敏感性。研究者此前已表明，使用碘化丙啶（PI）染色标记死亡神经元，10 μM谷氨酸处理c9ALS/FTD iPSNs 4小时会导致更多细胞死亡，而对照iPSNs中细胞死亡较少。在本研究中，研究者验证了这些发现（图2A和B），并进一步发现，用PARP1/2抑制剂niraparib或veliparib进行5天预处理能够降低PAR水平并减少谷氨酸诱导的神经元死亡（图2A和B）。此外，PARP1 RNAi或PARG过表达同样抑制了c9ALS/FTD iPSN#1细胞系中的谷氨酸诱导神经元死亡（图S2D），提示降低PAR水平可能减轻c9ALS/FTD iPSNs的神经毒性。此外c9ALS/FTD iPSNs的PAR水平较对照iPSNs显著升高（图2C和D）。为了直接评估R-DPR在iPSN中的毒性，研究者用(GR)20或(PR)20处理对照iPSN系（Ctrl#1），并通过测量因细胞膜受损导致神经元释放乳酸脱氢酶（LDH）评估细胞毒性。如图2E所示，5 μM的(GR)20或(PR)20处理2天显著增加了iPSN的LDH释放。此外，5 μM的PARP抑制剂niraparib或veliparib预处理1天，能够减少(GR)20或(PR)20诱导的PAR水平升高和LDH释放，但不影响细胞内多聚(GR)或多聚(PR)水平（图2E）。图2 Parp/PARP1 功能缺失抑制 c9ALS/FTD iPSN 中的神经变性。以上数据表明，下调PAR能够减轻果蝇及iPSN模型中c9ALS/FTD的神经变性。根据既往文献报道，研究者假设PAR 可能与 R-DPRs 结合，从而促进其聚集。研究者首先在瞬转过表达 GFP 标记的 50 次重复 DPRs [(DPR)50-GFP] 的人胚肾细胞（HEK293T）中进行了免疫共沉淀（co-IP）实验，为了抑制细胞裂解引发的外源性 PARP 和 PARG 激活，避免干扰 co-IP 结果，研究者在裂解液和免疫沉淀缓冲液中加入了 PARP 抑制剂 PJ34 和 PARG 抑制剂，结果如图 3A 所示，(GR)50-GFP 和 (PR)50-GFP 与 PAR 共同免疫沉淀，表明 PAR 可以在细胞中与 R-DPRs 结合。通过点杂交结合实验发现与对照及其他 DPRs 相比(GR)20 和 (PR)20 与化学合成的 PAR 结合能力更强（图 3B）。研究者进一步测试PAR是否可以在相同的缓冲液中促进 R-DPR 液-液相分离LLPS。研究者用 5-羧基四甲基罗丹明（TAMRA）荧光团标记了 (GR)20 或 (PR)20，发现PAR 而非 MAR促使 TAMRA 标记的 R-DPRs 相分离形成凝聚物（图 3C），FRAP测定显示这些凝聚物可以在光漂白后发生部分荧光恢复（图 3D和3E）。并进一步使用受体光瞟白法测定FRET表明PAR与R-DPR存在直接相互作用。三、PARP1活性缺失抑制了R-DPR诱导的应激颗粒（SG）形成根据既往文献报道，研究者假设PARP1活性丧失可能缓解R-DPR诱导的SG形成。为了研究R-DPR诱导的SG形成，研究者使用SG标志物G3BP1和Ataxin-2对瞬转过表达(GR)50-或(PR)50-GFP的HEK293T细胞进行了8小时、24小时或48小时的染色。在过表达8小时后，研究者未观察到SG的形成（统计约150个细胞）；然而，在过表达24小时或48小时后，约30%-40%的GFP表达细胞出现SG（图4A和B），表明与亚砷酸盐（可在1小时内诱导SG形成）相比，R-DPR诱导的SG形成较为缓慢。与之前研究一致，(GR)50-GFP定位于SG，而(PR)50-GFP则没有（图4A）。研究者测试了PARP1敲除（KO）是否能够缓解R-DPR诱导的SG形成。如图4（A和B），PARP1 KO在(GR)50-或(PR)50-GFP过表达24小时或48小时后减少了具有SG的细胞比例。研究者选择24小时时间点进行后续分析。与PARP1 KO类似，1 μM niraparib或veliparib的2小时预处理在(GR)50-或(PR)50-GFP过表达24小时后也减少了具有SG的细胞比例（图4C）。PARP1 KO或PARP抑制剂未减少GFP、G3BP1或Ataxin-2的表达量（图4D和E）。图 4. PARP1 活性的缺失抑制了 R-DPR 诱导的 SG 形成。综上所述，PARP1活性缺失可减少R-DPR诱导的SG形成。四、PAR促进G3BP1聚集及其与poly(GR)的相互作用先前的研究表明， eIF2α的磷酸化在R-DPR诱导的SG形成过程中起关键作用，因为eIF2α激酶抑制剂或磷酸化缺失突变能够阻止R-DPR过表达诱导的SG形成。然而，在表达(GR)50-或(PR)50-GFP的细胞中，PARP1敲除（KO）或抑制剂并未减少磷酸化eIF2α（图4D和E），表明PARP1并不通过促进eIF2α磷酸化来调控SG形成。SG的组装是通过SG蛋白的聚集介导的，其中G3BP1起着关键作用。当与RNA结合时，G3BP1发生液-液相分离（LLPS），从而驱动SG的组装。敲除G3BP1及其同源物G3BP2可完全抑制亚砷酸盐或R-DPR诱导的SG形成，而单独过表达G3BP1则可在无额外应激条件下诱导SG形成。鉴于PAR在结构上与RNA相似，研究者假设PAR也能够促进G3BP1的LLPS，从而驱动SG的形成。支持这一假设的是既往研究表明G3BP1可被PAR化并与PAR结合，且免疫荧光染色检测到亚砷酸盐诱导的SG中存在PAR。为验证这一假设，研究者将合成的PAR与Alexa-488标记的重组G3BP1（G3BP1-A488）混合。如图5A和B所示，PAR而非MAR能够诱导G3BP1-A488发生相分离。通过使用PAR-Cy5结合荧光漂白恢复实验（FRAP实验），研究者发现聚集体中的PAR和G3BP1部分是可恢复的（图5C和D），表明PAR能够促进G3BP1的LLPS。鉴于G3BP1在SG组装中的重要性，研究者假设R-DPR可能也能够促进其聚集。此外，由于PAR能够与R-DPR结合，而G3BP1可以被PAR化，研究者进一步假设PAR能够调控R-DPR与G3BP1的相互作用，并增强R-DPR促进G3BP1聚集的能力。研究者首先通过Western blot验证了R-DPR与G3BP1的相互作用。此外，考虑到poly(GR)而非其他DPR的包涵体与神经退行性变及临床病理亚型相关，且poly(GR)而非poly(PR)在体内与SG蛋白共同聚集，研究者将后续研究的重点放在poly(GR)上。为测试PAR是否调节(GR)50-GFP与G3BP1的相互作用，研究者在PARP1敲除细胞或去除缓冲液中PARG的条件下进行了co-IP实验。如图5E和F所示，这两种方法均减少了PAR并抑制了这种相互作用，表明PAR能够增强G3BP1与poly(GR)的相互作用。为验证poly(GR)是否也能促进G3BP1的聚集，研究者将TAMRA-(GR)20与G3BP1-A488混合，发现它们形成了聚集体（图5G和H）。此外，在无PAR蛋白无法形成聚集体的情况下，PAR通过诱导G3BP1/poly(GR)凝聚体的形成促进了这一过程（图5G和I）。这些数据表明，PAR能够促进G3BP1的聚集及其与poly(GR)的相互作用。图 5.PAR 促进 G3BP1 缩合和与 poly （GR） 的相互作用。五、PAR促进poly(GR)诱导的TDP-43聚集SG的组装以及poly(GR)能够触发TDP-43的聚集，poly(GR) 与培养细胞中SG内的TDP-43共定位，poly(GR)促进TDP-43的聚集可能在c9ALS/FTD的发病机制中发挥作用。为研究PAR是否调控poly(GR)诱导的TDP-43聚集，研究者将TAMRA-(GR)20与A488标记的重组TDP-43（TDP-43–A488）在有或无PAR的条件下混合。如图6A和B所示，TAMRA-(GR)20和TDP-43–A488形成了不规则形状的类聚集体。为了定量类聚集体中的蛋白量，研究者通过离心沉淀聚集体，用尿素缓冲液溶解后测量A488和TAMRA的荧光强度（图6C）。如图6D所示，与对照相比，PAR而非MAR显著增强了沉淀中的A488信号，表明PAR能够促进poly(GR)诱导的TDP-43聚集。值得注意的是，如果初始混合物中未包含TAMRA-(GR)20，则沉淀中几乎检测不到A488信号（图6D），表明在该条件下，PAR本身无法引起TDP-43的聚集。为了进一步验证PAR是否促进体外poly(GR)诱导的TDP-43凝聚，研究者利用浊度测定法对poly (GR) 和TDP-43共孵育60分钟后的溶液进行测定（图6E）。如图6F所示，与对照组相比，PAR（而非MAR）引起了更显著的浊度增加。此外，如果混合物中不包含(GR)20，则浊度增加很少（图6F），这一结果与图6D的数据一致。这些数据表明，在体外实验中，PAR能够促进poly(GR)诱导的TDP-43凝聚。接下来，研究者测试了PAR是否促进细胞中poly(GR)诱导的TDP-43聚集。为诱导内源性TDP-43聚集，研究者采用了一种先前发表的方法，即将化学合成的poly(GR)肽添加到细胞的放射免疫沉淀（RIPA）缓冲液裂解物中。如图6G和H所示，50 μM的(GR)20而非(GP)20导致了内源性TDP-43、PAR以及(GR)20本身的RIPA不溶性、尿素可溶性的聚集。此外，无论是通过PARP1敲除还是在细胞裂解缓冲液中去除PARG，都减少了尿素和RIPA组分中TDP-43和(GR)20的丰度（图6G和H），表明PAR在细胞裂解物中促进了poly(GR)和TDP-43的聚集。综上所述，PAR分别在体外和细胞裂解物中促进了poly(GR)诱导的TDP-43聚集。图 6.PAR 促进 poly （GR） 诱导的 TDP-43 聚集。六、PARP1/Parp的缺失抑制了C9ALS/FTD果蝇中R-DPR的聚集为了研究PAR是否在体内促进了R-DPR的聚集，研究者使用果蝇模型，并通过dot blot分析了老年果蝇头部的RIPA和尿素提取物，同时进行或不进行parpRNA干扰（RNAi）。如图7A和BB所示，parp RNAi降低了尿素组分相对于RIPA组分中的R-DPR水平，但对R-DPR总量无显著影响。另一个c9ALS/FTD果蝇模型，parp RNAi同样降低了尿素组分相对于RIPA组分中的poly(GR)-GFP水平（图7D）。综上所述，在c9ALS/FTD果蝇模型中，parp缺失可以抑制R-DPR聚集。七、PAR与患者尸检额叶皮层中的poly(GR)和TDP-43聚集相关联为了进一步探讨上述发现在人类中的意义，研究者分析了60例携带C9ORF72重复扩增突变、经神经病理学确诊为额颞叶变性（FTLD）或伴有运动神经疾病（FTLD-MND）的患者的额叶皮质尸检组织，不溶性PAR、poly(GR)和TDP-43之间的关系（图7E）。研究者通过dot blot结合密度分析的方法，测量了RIPA不溶性、尿素可溶性额叶皮质组分中的PAR和poly(GR)水平。此外，使用已建立的免疫检测测量了TDP-43在409或410位点的磷酸化形式，这是TDP-43的病理学形式。如图7F所示，在调整年龄、性别和疾病亚型（FTLD与FTLD-MND）后，不溶性PAR与poly(GR)和pTDP-43均呈正相关，这进一步支持了PAR与poly(GR)及TDP-43聚集之间存在关系。![]()
R-DPR在c9ALS/FTD的发病机制中起关键作用。体内外证据表明，R-DPR的毒性部分是通过引发异常的SG形成并诱导TDP-43等SG蛋白的聚集而实现的。然而，这些过程的调控机制尚不明确。在本研究中，研究者发现PARP1活性丧失能够抑制R-DPR诱导的SG形成。此外，PAR促进R-DPR的凝聚以及poly(GR)与TDP-43的共聚集，提示其可能在R-DPR的毒性中发挥作用。PARP1是DNA损伤的第一响应者。poly(GR)通过增加线粒体活性氧导致DNA损伤，而poly(GA)和G4C2重复RNA则分别通过破坏DNA修复机制和生成R-loops（一种可能引起双链断裂的DNA/RNA复合物）引发DNA损伤。因此，未来研究可以探讨DNA损伤是否导致c9ALS/FTD中PAR水平的升高。蛋白质聚集是神经退行性疾病的共同特征。已有研究表明，PAR在帕金森病模型中促进α-突触核蛋白的聚集及其毒性。本研究显示，PAR促进R-DPR诱导的TDP-43聚集，并且PARP1 RNAi或PARP1抑制剂能够抑制果蝇和iPSN模型中的神经变性。综合以上发现，提示PAR在蛋白聚集和神经退行性变中扮演重要角色。此外，过量的PAR除了促进蛋白聚集外，还会引发parthanatos并抑制轴突生长。相反，PARP1活性丧失会增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）水平，对神经元有潜在的益处。因此，抑制PARP1可能通过多种机制抑制c9ALS/FTD的神经退行性变。已有研究表明，PAR在不同研究系统中对TDP-43毒性的影响可能是有害的或有益的。果蝇或培养的神经元中，PARP敲低、PARG过表达或PARP1/2抑制能够抑制TDP-43过表达导致的神经变性，提示PAR促进TDP-43毒性。然而，PAR在体外实验中可以防止TDP-43的病理相分离和聚集，并促进其生理性的LLPS，表明其具有有益作用。本研究表明，单独的PAR不会引发TDP-43聚集。同时，尽管poly(GP)可以上调PAR水平，但并未引发细胞毒性或TDP-43聚集。相反，PAR能够促进poly(GR)诱导的TDP-43聚集，并加剧poly(GR)毒性。因此，PAR对TDP-43毒性的影响可能依赖于其他调控因子。TDP-43在患者组织中的聚集体还包含其他蛋白，未来研究可以进一步聚焦于这些蛋白、PAR、poly(GR)及TDP-43之间的相互作用如何影响其共聚集。SG的组装由SG蛋白与其他分子间相互作用网络介导。由于许多SG蛋白能够被PAR化或与PAR结合，PAR可能通过为该网络提供额外的作用来促进SG组装，从而加速聚集。已有研究表明，PAR诱导SG蛋白TDP-43和hnRNP A1的LLPS，而PARP1抑制剂分别延缓或抑制由亚砷酸盐或DNA损伤引发的SG组装。与这一观点一致，本研究表明PAR在体外诱导G3BP1凝聚，并且PARP1活性丧失减少了R-DPR诱导的SG组装，这提示PAR在蛋白质凝聚和SG形成中起着普遍作用。尚需解答的问题包括：作为核蛋白为主的PARP1如何导致细胞质中SG蛋白的PAR化。可能的机制是，这些蛋白在核内被PAR化后转运至SG；或者，这些蛋白由细胞质中的PARP1或由PARP1激活的其他PARPs直接PAR化。SG能够诱发TDP-43及其他SG蛋白的聚集，因此被认为与ALS/FTD的发病机制相关。尽本研究显示，PARP1活性丧失能够减少SG形成并抑制c9ALS/FTD的果蝇及细胞模型中的神经变性，进一步支持了SG形成在发病机制中的作用。由于若干PARP1抑制剂已获得FDA批准或处于癌症治疗的后期临床试验阶段，而veliparib在帕金森病小鼠模型中具有神经保护作用且无明显副作用，这些发现提示其具有潜在的临床转化价值。此外，在包括tau病、朊病毒病和白质消失症在内的其他疾病小鼠模型中，SG也被认为与神经退行性变有关，因此PAR可能也参与了这些疾病的发病机制。因此，以PAR为靶点可能是一种治疗这些疾病的潜在策略。为了进一步验证PAR作为ALS和FTD治疗靶点的潜力，需要在哺乳动物模型中验证上述研究结果。目前已有多个c9-及TDP-43-ALS/FTD的小鼠模型，未来研究可以探讨PARP1敲除或PARP抑制剂是否能够缓解这些模型中的神经退行性变及行为缺陷。此外，尽管患者脑神经元中的核内PAR水平升高，但更与SG组装及DPR与TDP-43聚集相关的细胞质PAR量目前尚不清楚。此外，c9ALS/FTD患者的脑脊液中PAR是否升高也未明确。最后，还需考虑PARP1抑制可能的潜在有害效应，因为PAR在细胞生理中发挥着重要作用。例如，PARP1抑制剂可能抑制DNA损伤修复并导致细胞死亡。此外，PAR对核仁结构和功能至关重要。因此，在神经元治疗中，识别PARP抑制剂的安全剂量至关重要。![]()
Gao J, Mewborne QT, Girdhar A, Sheth U, Coyne AN, Punathil R, Kang BG, Dasovich M, Veire A, DeJesus Hernandez M, Liu S, Shi Z, Dafinca R, Fouquerel E, Talbot K, Kam TI, Zhang YJ, Dickson D, Petrucelli L, van Blitterswijk M, Guo L, Dawson TM, Dawson VL, Leung AKL, Lloyd TE, Gendron TF, Rothstein JD, Zhang K. Poly(ADP-ribose) promotes toxicity of C9ORF72 arginine-rich dipeptide repeat proteins. Sci Transl Med. 2022 Sep 14;14(662):eabq3215. doi: 10.1126/scitranslmed.abq3215. Epub 2022 Sep 14. PMID: 36103513; PMCID: PMC10359073.校 审：商慧芳
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