TYK2调控小鼠模型中Tau蛋白水平、磷酸化和聚集
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2024-12-19 17:00
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阿兹海默症（Alzheimer’s disease, AD）其中主要的病理特征为神经元和胶质细胞内Tau蛋白的沉积，Tau蛋白主要在神经元内表达，与微管蛋白结合，维持正常细胞的生理功能。Tau蛋白可以受到多种翻译后修饰，在病理状态下，Tau蛋白会出现以过度磷酸化为主的翻译后修饰，进而从微管解离，发生错误折叠并传播至临近细胞内。然而目前对于可溶性Tau蛋白发生错误的翻译后修饰，并且进一步形成不可溶性聚集体的因素仍不明确。近期，美国贝勒医学院Huda Yahya Zoghbi 团队通过前期跨物种遗传筛选，筛选出Janus激酶家族成员酪氨酸激酶2（Tyrosine kinase 2, TYK2），其通过磷酸化底物蛋白的酪氨酸残基，对Tau蛋白酪氨酸磷酸化和Tau蛋白水平进行了调控，研究发表在Nature Neuroscience杂志。![]()
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研究分别利用多种体内（PS19小鼠）和体外模型（神经细胞系、原代神经细胞、工具细胞等），利用AAV技术在小鼠体内调控Tyk2的表达，通过多种分子生物学手段，例如荧光共振能量转移（FRET）实验检测Tau种子活性，不溶性蛋白的提取和鉴定等，明确TYK2在Tau磷酸化和病理性Tau聚集的作用。![]()
研究者在BE-2C和SH-SY5Y细胞系中进行shRNA慢病毒敲低TYK2水平，并平行用TYK2小分子抑制剂进行TYK2酶活性抑制，均发现降低TYK2可以降低Tau蛋白内源性水平，反之亦然，表明TYK2活性调节内源性Tau蛋白水平（见原文补充材料）。在体内水平，研究者通过AAV8将Tyk2 shRNA腺病毒脑室内注射至新生小鼠中，结果同样显示Tyk2敲低降低内源性Tau蛋白水平（图1a-b），研究者还在Tyk2E775K杂合和纯合小鼠（Tyk2E775K突变后蛋白稳定性降低，mRNA产生但无蛋白水平表达）同样发现了内源性Tau蛋白水平的降低（图1c），将Cre-AAV8注射至Cre依赖的Tyk2小鼠（Tyk2tm2a/tm2a）中，成年小鼠大脑中Tau蛋白降低（图1d），其中主要降低的细胞包含神经元和星形胶质细胞。研究者首先在工具细胞HEK293T中内源性Tau蛋白进行免疫共沉淀，证实Tau蛋白和TYK2内源性互作，进一步通过不同Tau蛋白片段互作后显示Tau蛋白通过其微管结合重复扩增区域与TYK2互作，对表达TYK2和Tau441（2N4R Tau）进行IP发现，存在TYK2情况下Tau的酪氨酸残基被磷酸化。随后，研究者突变Tau蛋白的酪氨酸残基为苯丙氨酸（Y18、Y29、Y197、Y310和Y394），并产生突变形式的Tau蛋白（Tau441_5Y-F），TYK2敲低后Tau441 WT形式的降解，但不能促进Tau441_5Y-F的降解，表明TYK2酪氨酸磷酸化稳定Tau的蛋白的水平（见原文补充材料）。3. TYK2通过Tyr29磷酸化稳定Tau蛋白水平研究者通过体外激酶测定结果发现，除Y29F位点外，其它4种突变形式的Tau蛋白均能被TYK2磷酸化（图2a-c）。同时，利用Tau蛋白胞内抗体HJ8.5（特异性识别Tau蛋白25-30残基，即跨越Y29残基）可以阻断TYK2磷酸化（图2d）。随后，利用Y29磷酸化抗体（pY29）在TauWT组检测出磷酸化Tau，而HJ8.5抑制后未能检测到（图2e）；而磷酸化抗体（pY18）则能检测FYN磷酸化的Tau蛋白（图2f）。进一步地，研究者利用四环素诱导的Tau441-WT和Tau441-Y29F病毒转导小鼠皮质神经元原代细胞，多西环素DOX处理细胞24h后诱导Tau蛋白表达，去除DOX 72h后不同时间点收集细胞，显示TYK2的表达稳定了Tau441蛋白（图2g, i），但不影响Tau441-Y29F的表达（图2h, j），表明TYK2介导Tyr29的磷酸化可以稳定Tau蛋白。图2：TYK2在Tyr29残基处磷酸化Tau并稳定Tau蛋白进一步，TYK2和TYK2激酶结构域（TYK2KD）增加了Tau-WT泛素化水平，但不影响Tau441-Y29F的泛素化（图3a），且TYK2增加了K63-Ub-Tau的水平（图3b）。抑制自噬水平可以恢复Ub-Tau水平（图3c），自噬抑制剂恢复了TYK2抑制剂对Tau蛋白降低情况（图3d），由此提示TYK2介导的Tyr29磷酸化可以通过抑制自噬依赖性的Tau降解途径，进而稳定Ub-Tau水平。图3. TYK2介导的Tyr29磷酸化可以通过抑制自噬依赖性的Tau降解途径稳定Ub-Tau4. TYK2蛋白水平与AD脑组织磷酸化Tau有关AD患者TYK2蛋白水平较HC减少（图4a-b），TYK2水平与病理性磷酸化Tau正相关（图4c），并且TYK2的剪切片段与过度磷酸化Tau有关（图4d）。添加老年PS19小鼠脑组织不溶性裂解物（包含Tau蛋白种子）至HEK293T细胞后，TYK2促进病理性Tau441-P301S聚集，但不影响Tau441-Y29F/P301S的聚集（图4e）。图4. TYK2蛋白水平与AD脑组织磷酸化Tau有关研究者将Tau441-P301S-YFP和Tau441-Y29F/P301S-YFP转染至HEK293T中（图5a），利用TYK2抑制剂处理细胞，结果显示，TYK2增加Tau蛋白聚集，并被TYK2抑制剂或Tau441-Y29F抑制（图5b-c）。同时在没有种子的情况下，Tau蛋白也能自行聚集，而Y29F/P301S Tau蛋白形成的聚集减少（图5e-g）。6. Tau Tyr29磷酸化的同时促进该位点硝基化既往已知CAPON介导的Tyr29硝化导致Tau小鼠模型病理形式的聚集，研究者将CAPON、TYK2转染至HEK293T细胞中，显示TYK2介导的Tyr29磷酸化增强了同样位点的硝化，而硝化CAPON的过表达或抑制均不影响Tau蛋白聚集（图6b），且不影响TYK2磷酸化对Tau聚集的影响。图6. Tau Tyr29磷酸化的同时促进该位点硝基化7. TYK2介导的Tyr29磷酸化促进P301S Tau转基因小鼠病理性Tau积累研究者在新生小鼠进行Tau441-P301S或Tau441-Y29F/P301S脑室内注射，同时共同注射TYK2KD-YFP（TYK2KD可用于AAV，且酶活性更强，并能磷酸化Tau Tyr29）（图7a-b）。在注射1-2月后，转基因小鼠表达的P301S Tau蛋白水平增加（图7c），且同属注射TYK2KD-YFP的Tau441-P301S小鼠病理性蛋白PHF1 Tau磷酸化和硝基化信号增强（图7d-e），而在Tau441-Y29F/P301S小鼠中信号减少；同时TYK2KD增加了不溶性P301S Tau聚集体形成，且大分子量的Tau蛋白增加（图7f），表明TYK2磷酸化Tyr29可以促进Tau小鼠模型中Tau蛋白的累积。图7. TYK2介导的Tyr29磷酸化促进P301S Tau转基因小鼠病理性Tau积累8. TYK2敲低可以减少Tau小鼠模型中病理性Tau水平研究者在新生PS19小鼠脑室内注射Tyk2 shRNA-AAV8，9月龄时Tyk2水平降低（图8a），且小鼠脑匀浆显示Tau种子减少（图8b），同时总Tau和病理性Tau水平均降低（图8c-d），且AD的其它病理，如小胶质细胞和星形胶质细胞增生也较对照减少（图8e-f）。图8. TYK2敲低可以减少Tau小鼠模型中病理性Tau水平和AD病理![]()
该研究提出了Tau磷酸化和病理性聚集的关键酪氨酸激酶TYK2的重要作用，即TYK2及底物Tau Tyr29残基磷酸化可以直接影响人类细胞和小鼠脑内Tau蛋白水平和Tau蛋白聚集，进而影响Tau的病理学过程，表明TYK2的抑制可能是减少Tau蛋白毒性的潜在靶点。Kim J, Tadros B, Liang YH, Kim Y, Lasagna-Reeves C, Sonn JY, Chung DC, Hyman B, Holtzman DM, Zoghbi HY. TYK2 regulates tau levels, phosphorylation and aggregation in a tauopathy mouse model. Nat Neurosci. 2024 Dec;27(12):2417-2429. doi: 10.1038/s41593-024-01777-2. Epub 2024 Nov 11. PMID: 39528671; PMCID: PMC11614740.校 审：商慧芳
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