Oligo 7设计的引物对引物有一个综合评价,同时概括了引物关键信息,可分析引物的二聚体形成、发夹结构、上游&下游引物和产物各个碱基的组成比例和Tm值、错配情况、PCR总览、内部稳定性等,通过这些分析可以确保自己的引物是不是最合适的。
Primer Premier 6引物设计教程
Primer Premier 6,3分钟教你完成引物设计(含软件安装)
引物设计软件下载
以下引物设计软件安装包,可以在科研根号三回复“引物设计”下载!
① Oligo 6、Oligo 7;
② Primer Premier 5、Primer Premier 6;
③ Primer Express 3;
④ BeaconDesigner 8。
Oligo 7引物设计
1)查找基因序列
以human p53 为例进行引物设计,p53在human中的基因名为TP53。
打开NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),数据库选择Gene,搜索框输入“TP53 human”,点击Search。
检索结果第一条就是我们要找的TP53 基因,点击进入下一页面。
点击右侧边栏的NCBI Reference Sequences (RefSeq)查看序列信息。
点击【NM_000546.6】进入下一个页面。
往下翻,找到【CDS】,点击进入下一个页面。
如下页面点击右下角【FASTA】。
下面框出来的就是我们需要的p53基因序列,复制序列信息。
2)设计引物
打开 oligo 7,菜单栏File→New→ Sequence,或者快捷键Ctrl+N,都可以调用出序列粘贴窗口,然后将目的序列粘贴进来,点击回车或者是如下图所示的√,开始设计引物。
Search 菜单下,选择 for primes &probes ,调用出引物查找窗口。
根据自己的实际情况,选择Parameters 设置引物的相关参数。
选择Constraints,Primer Length选项设置引物长度,Primer Im Range选项设置解温度。设置完之后点击OK。
点击Ranges设置引物范围。
PCR product length栏目根据自己的需求设置引物长度,然后点击OK。
然后点击 Search 即开始进行引物的搜索,之后会出现oligo所列出的按照得分(Score)高低排列设计的引物。
3)引物分析
双击每一行所列出的引物会弹出该对引物和产物的基本信息,以及对PCR反应的评价。
点击Sequence页面可以查看引物的详细信息。点击绿色方形图标前面的 i 图标可了解对应的具体信息。
接下来是Analyze 功能菜单下对该引物的具体分析。
这里可以看到引物的概括信息、引物的二聚体形成分析、发夹结构分析、上游&下游引物和产物各个碱基的组成比例和Tm值、错配情况、PCR总览、内部稳定性等这些项目的详细分析,通过这些分析可以确保自己的引物是不是最合适的。
Analyze→Key info:点击Selected primers,会给出两条引物的基本信息,基本信息包括引物的 Tm值,Oligo是采用nearest neighbor method计算Tm值,会比Primer5中引物的Tm值略高一点。
这里需要确保3`△G|≤9kcal/mol,以防止在错配位点形成双链结构引起DNA聚合反应。如果没有问题就继续往下分析。
Analyze→Duplex Formation:这里是指二聚体形成分析,可以选择“Forward Primer”,“Reverse Primer”,分析上游引物或下游引物的二聚体形成情况。
引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素,因此应该避免设计的引物存在二聚体,至少要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的,即其△G值应该偏低,一般△G≤4.5kcal/mol,(结合碱基对)hydrogen bonds≤3。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和△G 值。
Analyze→Hairpin Formation:接下来是夹结构分析,可以选择上游或者下游引物,同样,△G≤4.5kcal/mol,(结合碱基对)hydrogen bonds≤3。
Analyze→Compositionand Tm:这里会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm 值。上下游引物的GC%需要控制在40%~60%,而且上下游引物之间的GC%不要相差太大。Tm值共有3个,分别采用三种方法计算出来,包括nearest neighbormethod、%
GC method和2(A+T)+4(G+C)method,最后一种应该是 Primer5所采用的方法,Tm 值可以控制在50~70度之间。
Analyze→False Priming Sites:这里是错误引发位点分析,在Primer5中虽然也有False priming分析,但不如oligo 详细,而且oligo会给出正确引发效率和错误引发效率,一般的原则要使误引发效率在100以下,如果正确位点的引发效率很高的话,比如达到400~500,错误引发效率超过100幅度若不大的话,也可以接受。
Analyze→PCR:这是最有参考价值一项,这里是基于这对引物的PCR反应总结,同时给出了此反应的最佳退火温度,另外,提供了对于此对引物的简短评价(Comments)。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在,并且△G值偏大的话,Oligo在最后的评价中会注明,若没有注明此项,表明二级结构能值较小,基本可以接受。
Analyze→Internalstability:稳定性分析这里的结果最好是中间高两边低的弧形。这样的引物稳定性高,成功概率更高。如果这条不符合问题也不大,仅作为参考选项。
File→Save→Data as,设置保存路径及文件名即可。
Oligo 7 安装教程
打开Oligo 7安装包文件夹,双击运行“Oligo 7”应用程序
oligo7的运行环境需要JRE 1.4及以上版本方能正常使用,所以用户在安装oligo前请先保证电脑中已将安装了java。
如果提示“This application requires a Java Runtime Environment1.4.0(此应用程序需要Java运行时环境1.4.0)”,就需要安装java。
在弹出来的页面中点击“确定”,之后会打开浏览器进入到java下载页面
点击【下载java】;
点击【安装】,根据安装步骤,完成java安装。
安装完java之后,重新回到Oligo 7安装文件中,继续Oligo 7安装激活。
双击Oligo 7应用程序,进入到软件激活的页面。(绿色版没有安装步骤,双击就能打开软件主页面)
首次打开Oligo 7 软件会提示需要激活软件。
回到下载的安装包,打开Oligo 7注册机。
打开的注册机如下。
将ologo 7 软件激活页面上的workstation code复制粘贴到注册机上的workstation code,再点击注册机上的Generate按钮。
上一步在注册机上点击Generate之后,注册机上会生成Acesscode。将注册机上的AcessCode复制粘贴到oligo7激活页面上的Acess Code内。
在oligo7激活页面点击Confirm code,到这里就完成oligo7的激活了。
oligo7软件打开页面如下。
注意:软件激活完之后不会自动创建快捷方式,需要在安装包内将软件创建快捷方式到桌面。
另外安装包可以放在电脑的任意磁盘,记住,不要删掉安装包!
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