不同细胞死亡中被广泛应用的「关键分子」

细胞死亡一直是高居不下的热点，各种研究层出穷，我们也没少写，基本上不同形式的细胞死亡都盘了个遍。

今天这篇内容就总结一下不同细胞死亡中被广泛应用的关键分子，帮助大家轻松开启科研之旅！

铁死亡（Ferroptosis）是铁依赖性的磷脂过氧化作用驱动的一种独特的细胞死亡方式，受到多种细胞代谢途径的调控，其中包括氧化还原稳态、铁代谢、线粒体活性和氨基酸、脂质、糖的代谢，以及各种与疾病相关的信号途径。

其中，GPX4和SLC7A11近年来被更广泛地研究与引用。

在GPX家族中，谷胱甘肽过氧化物酶4 （GPX4, Glutathione peroxidase 4）因其独特的抗膜脂氧化能力而备受关注。2012年铁死亡被报道，GPX4因其在调节疾病和癌症进展中的作用再次成为研究热点。

GPX4是最重要的抗氧化酶之一，也是铁死亡的关键调控因子。它通过保守的催化三联体硒代半胱氨酸46、天冬酰胺81和色氨酸136直接还原磷脂氢过氧化物。GPX4的反应动力学被描述为乒乓模式，体现在两个阶段。

首先，过氧化物通过活性位点硒代半胱氨酸46还原，然后转化为氧化形式。第二阶段是通过谷胱甘肽补充氧化催化位点。谷胱甘肽（GSH）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的含量直接影响GPX4活性。

Xc- system是一种非钠的逆向转运蛋白，以1:1的比例输出胞内谷氨酸和胞外胱氨酸。它由两个通过二硫键连接的亚基组成，包括重链亚基溶质载体家族3成员2（SLC3A2；也称为CD98或4F2hc）和轻链亚基溶质载体家族7成员11（SLC7A11；通常也称为xCT）。

SLC7A11是一种多通道跨膜蛋白，介导Xc- system中的胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白活性，而SLC3A2是一种单一跨膜蛋白，是维持SLC7A11蛋白稳定性和适当的膜定位的分子伴侣。目前，对Xc- system的研究重点在SLC7A11。

由于半胱氨酸是GSH合成的前体，而胞内半胱氨酸主要由SLC7A11介导的胱氨酸摄取提供。大量研究表明，SLC7A11介导的胱氨酸摄取在抑制氧化应激条件下的铁死亡和维持细胞存活方面的关键作用。因此，SLC7A11被认为是铁死亡的关键调节蛋白。

NRF2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2）是抗氧化作用中的关键转录因子， 在细胞内铁浓度的调节中发挥重要作用。

NRF2在基础条件下不稳定，会被E3泛素连接酶KEAP1（Kelch-like ECH-associated protein 1）泛素化，随后通过蛋白酶体途径进行快速降解。

然而，在氧化应激下，NRF2从KEAP1中释放并易位到细胞核中，随后与抗氧化反应元件（ARE,santioxidant response elements）相互作用，驱动抗氧化基因的表达，从而保护细胞免受氧化应激的影响。

据报道，NRF2通过增强细胞的抗氧化能力来抑制铁死亡；KEAP1失活可导致NRF2在基础条件下的稳定，KEAP1缺失促进了铁死亡的抗性。因此，KEAP1、NRF2也被认为是铁死亡的关键调控因子。

脂质过氧化是铁死亡的标志，它直接破坏细胞膜，从而导致铁死亡。而脂质过氧化的一个主要途径就是酶促脂质过氧化，由脂氧合酶 （LOX,lipoxygenase） 家族的活性介导，该酶可以氧化游离和酯化的多不饱和脂肪酸（PUFAs, polyunsaturated fatty acids）以产生过氧化物自由基。

在这个过程中，酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（LPCAT3）促进PUFAs掺入磷脂中形成多不饱和脂肪酸磷脂（PUFA-PL）。PUFA-PL易发生花生四烯酸脂氧合酶 （ALOXs,Arachidonic acid lipoxygenases） 诱导的脂质过氧化，最终最终导致脂质双分子层的破坏，并影响细胞膜功能，进而促进铁死亡。

血红素氧合酶1(HO-1, Heme Oxygenase-1)是一种抗炎症和抗氧化的胞内酶，可将血红素代谢为亚铁、一氧化碳（CO）和胆绿素。有研究表明，HO-1的表达和活性升高会增加游离铁的水平以及铁蛋白的表达。并且，慢性HO-1过表达会导致正常细胞中铁过量，从而促进细胞内毒性和细胞死亡。

NRF2/HO-1信号通路是保护细胞免受氧化应激的重要信号通路。HO-1受NRF2调控，当NRF2被激活时，它促进HO-1的表达，HO-1表达的上调可调节抗氧化酶将自由基转化为水和分子氧，减少氧化应激损伤和氧化产物的产生，发挥抗氧化作用。大量研究表明，NRF2/HO-1信号通路具有抑制铁死亡的作用。

除了典型的基于谷胱甘肽的GPX4通路外，FSP1-CoQ10-NAD (P)H通路作为一个独立的系统，与GPX4和谷胱甘肽协同抑制磷脂过氧化和铁死亡。铁死亡抑制蛋白1（FSP1 , Ferroptosis Suppressor Protein 1；以前称为AIFM2）可以通过NADH作为辅助因子，直接还原氧化的CoQ10。

此外，二氢乳清酸脱氢酶（DHODH, dihydroorotate dehydrogenase）被确定为一种线粒体铁死亡抑制剂，其通过减少线粒体CoQ10发挥作用，类似于线粒体外膜中FSP1的功能。

关于细胞凋亡的研究普遍是从以下几个方面入手：与细胞凋亡相关的基因、分子及其调控机制；细胞凋亡相关信号通路以及信号转导过程；细胞凋亡相关分子之间的相互作用；细胞凋亡相关研究的临床应用。

由此可见，掌握凋亡相关基因 —— 凋亡中的关键分子Bcl-2、Caspase 家族、死亡受体家族，对进一步研究凋亡的具体机制来说至关重要。

Bcl-2 家族成员包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，它们的比率决定了细胞对各种死亡信号的敏感性。Bcl-2 家族控制着线粒体外膜和内膜的通透性，因此是线粒体凋亡途径的主要调控者，它们通过激活一系列下游基因发挥调节凋亡作用。

抗凋亡成员包括 Bcl-2、C-xl、bCL-W、mL-1 和 B-1/A1，这些蛋白定位在线粒体或内质网上。这些抗凋亡蛋白通过结合或分解促凋亡蛋白而阻止细胞死亡。

促凋亡成员根据功能和结构不同分为两个亚类：一种为多结构蛋白，如 Bax 和 Bak，但缺少 N 端 BH4 结构域；另一种是单 BH3 结构的 Bcl-2 家族成员，包括 Bik，Bim，Bid，Puma/BBC3 和 Noxa/APR，而每个成员都介导特定的细胞死亡信号 

Caspase活化具有2种机制，即同源活化和异源活化，一般后者是前者的结果。

通常Caspase-8，-10，-2 介导死亡受体通路的细胞凋亡，分别被募集到 Fas 和 TNFR1 复合物；而Caspase-9 则参与线粒体通路的细胞凋亡，被募集到 Cytc/d ATP/Apaf-1 组成的凋亡体。

Caspase-10 活化后可裂解并激活 caspase-3 和-7，而其本身则由Caspase-8 加工，该基因突变与 IIA 型自身免疫淋巴增生性综合征、非霍奇金淋巴瘤和胃癌有关。

死亡受体是一组细胞表面标记，属于肿瘤坏死因子受体超家族。死亡受体家族的胞内部分都含约 80 个氨基酸残基，共同组成介导凋亡的区域，称为死亡结构域。该结构域很重要，可将胞外信号传递到胞内，进而引发凋亡。

配体与死亡受体相结合类型主要有 FASL/FASR、TNF-α/THFR1、APO3L/DR3、APO2L/DR4、APO2L/DR4/DR5、TRAIL/DR5、DQM3/DR6 等。

自噬（autophagy = self-eating）意为自体吞噬，是真核细胞在自噬相关基因（autophagy related gene，Atg）的调控下利用溶酶体降解自身细胞质蛋白和受损细胞器的过程。

在自噬研究领域，LC3与P62是众所周知的关键分子。

LC3全称 MAP1LC3 ，贯穿整个自噬过程，是目前公认的自噬标记物。

哺乳动物的 LC3可分为3种：LC3A、LC3B 和LC3C。其中，LC3B应用最为广泛。

LC3/Atg8 被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸残基，产生定位于胞浆的LC3-I。在自噬过程中，LC3-I会被包括 Atg7 和Atg3（分别对应E1和E2样酶）在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）相偶联，形成LC3-II附着到自噬体的膜上，是自噬体的结构蛋白。

在自噬体和溶酶体融合后，位于外膜上的 LC3-II 被 Atg4 切割，产生 LC3-I 循环利用；内膜上的 LC3-II 被溶酶体酶降解，导致自噬溶酶体中 LC3 含量很低。

因此LC3-I与LC3-II在自噬发生发展过程中是生成-降解的过程，出现后又离开，单一时间点对LC3-II表达量的检测是无法严谨说明自噬的改变。

▲由于 LC3 的动态变化以及 LC3A/B/C 具有种属细胞/组织分布特点，以及 LC3-I  对反复冻融的敏感性，在采用 Western blot 等实验方法检测 LC3 时应注意以上要点。

根据底物靶向运输至溶酶体的方式不同，自噬可分为巨自噬、微自噬、分子伴侣介导的自噬三大类。

胞质成分会被成批降解或选择性自噬靶向降解，哺乳动物的选择性自噬依赖于两种主要成分：除了脂化LC3蛋白，还有选择性自噬受体。

其中，SQSTM1/P62就是第一个被发现的选择性自噬受体，且越来越多的证据支持P62 与神经退行性疾病、免疫性疾病和癌症等多种疾病发生相关。因此P62在自噬中的作用不言而喻。

除上文提到的LC3外，其他自噬底物表达量的变化也可以用于监测自噬流。P62是研究广泛的一个自噬底物。在自噬体形成过程中，P62作为连接 LC3和聚泛素化蛋白之间的桥梁，被选择性地包裹进自噬体，之后被自噬溶酶体中的蛋白水解酶降解，所以P62蛋白的表达量与自噬活性呈现负相关。

细胞内基础自噬水平较低，不利于研究者观察，因此在自噬研究领域存在各种自噬激活剂与自噬抑制剂分别激活/抑制不同阶段的自噬。

不同调节剂对LC3与P62的表达与调控，存在差异：

细胞焦亡（Pyroptosis），又称细胞炎性坏死，是近年来新发现的一种程序性细胞死亡，由炎性小体引发，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。

细胞焦亡的关键执行分子是Gasdermin蛋白家族。

Gasdermins是一个蛋白家族，有6个副同源基因编码：GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME、DFNB59。

如下图所示，为了应对攻击，Gasdermins（GSDM）通过蛋白水解裂解激活，释放N末端片段，形成大的细胞膜孔。通过细胞孔膜可以释放炎症因子，从而触发细胞焦亡。细胞内小分子，包括细胞因子和细胞警报蛋白,通过GSDM孔释放，引起炎症。

Gasdermins在不同细胞中的激活机制是不一样的，主要分为以下几种：

1）凋亡信号细胞：GSDMC和GSDME分别由半胱天冬酶8和3处理，将凋亡转化为焦亡。

2）杀伤细胞：分泌的Gzms通过穿孔素递送到靶细胞，其中GzmsA和GzmsB可分别直接切割和激活GSDMB和GSDME，引发细胞焦亡。

3）免疫细胞：对微生物或危险信号做出反应的炎症小体、脂多糖（LPS）或内源性氧化磷脂的非典型炎症小体都会激活炎症半胱天冬酶（半胱天冬酶1、4、5和11），后者切割GSDMD并产生形成孔的N末端（GSDMD-NT）。

4）巨噬细胞：TAK1被YopJ或小分子5z7抑制，触发半胱天冬酶8依赖性GSDMD切割和活化。

5）中性粒细胞和单核细胞：GSDMD可以由中性粒细胞弹性蛋白酶（ELANE）和组织蛋白酶G直接加工或激活。

6）皮肤上皮细胞：GSDMA3的突变导致C端GSDM抑制的消除并触发GSMDA3孔膜形成活性，触发细胞焦亡。

除此之外，作者还认为GSDM家族释放N末端片段，是由Caspase/Gzm-家族介导，GSDMD还可以被Neutrophil elastase和Cathepsin C两种酶切割。